生物可缩放纳米棒的生产的制作方法

本发明总体上涉及用于生产衍生自丝状噬菌体ff(f1、m13或fd)的生物可缩放官能化就绪纳米棒(bsfnano)的系统。该系统允许非感染性、热稳定的同构蛋白纳米棒的有效生物生产，纳米棒包括允许以正交方式位点特异性重组、化学和酶促附接肽和非肽官能团的修饰。

背景技术：

1、许多医学和纳米技术应用需要使用可被肽(蛋白)或非蛋白官能团正交官能化的颗粒(sarikaya等人，2003)。虽然非生物纳米颗粒已经用于一系列诊断和纳米技术应用，但是它们产生了几个问题，例如颗粒本身的毒性和由于在颗粒生产中使用有毒化学品而引起的可持续性问题(wang和tang，2020)。毒性妨碍了需要直接引入患者的医学治疗应用。此外，生产同构的和可正交修改的非生物纳米棒是非常困难的(corrigan等人，2021)。

2、迄今为止，在纳米技术和生物医学应用中已经使用了有限数量的生物纳米颗粒(包括纳米棒)。这些生物纳米颗粒中最突出的是丝状噬菌体ff，大肠杆菌k12的细菌病毒。噬菌体是噬菌体显示技术的核心，并且已经用作适合于附接官能团的生物颗粒。使用完整噬菌体或含有完整质粒(称为噬菌粒)的长噬菌体来源的丝状体的许多医学和纳米技术应用是已知的(barbas iii等人，2001)。

3、ff丝状噬菌体(包括f1、fd和m13种)在它们的基因间(ig)序列中携带复制和包装所需的dna序列(model和russel，1988；rakonjac等人，2017)。使用滚环模式一次一条链复制噬菌体。ff噬菌体的基因组是单链环状的(阳性；+)单链ssdna。第二(负的；通过宿主酶从(-)ori合成链，产生基因组(rf)的双链环状dna复制形式。rf用作复制和组装子代噬菌体所需的噬菌体蛋白的转录和翻译的模板。使用rf作为模板的正(+)链复制起点(ori)的滚环复制需要噬菌体编码的复制蛋白pii，并产生单链环状dna(ssdna)，其为丝状噬菌体基因组。

4、ssdna基因组中的长发夹结构用作丝状病毒体组装所需的包装信号。在感染周期的早期，ssdna从(-)ori复制以增加rf拷贝数(每个细胞高达50个拷贝)。这与感染后期相反，在感染后期ssdna被蛋白pv包被，形成组装病毒体所需的“包装底物”。包装底物中的ssdna形成沃森-克里克样螺旋，每条链与pv二聚体的一个亚基相互作用。例外是包装信号，即未被pv覆盖的真正dna螺旋。复合物称为“包装底物”，靶向组装病毒体的跨包膜组装-分泌机制。

5、(+)ori具有复制蛋白pii在(+)链中切割的位点，允许从用作引物的3'oh端开始复制。当合成新(+)链时，“旧”(+)链被置换。一旦(+)链复制完成整圈，在与起始点相同的位点通过pii进行切割，并且“旧”ssdna(+)链和新链都被密封。“旧”链或者用作(-)链复制的模板，以允许产生更多的dsdna，dsdna又成为新一轮(+)链复制的模板，或者被pv包被以形成用于组装后代病毒体的包装底物。

6、ff的噬菌粒颗粒与ff噬菌体相似，但是它们的基因组对应于质粒(称为噬菌粒)，质粒包括质粒复制起点，作为可选择标记的抗生素抗性基因，ff复制起点和通常编码病毒体外壳蛋白的ff基因中的一个(barbas等人，1991)。在医学和诊断应用中使用ff丝状噬菌体和衍生的噬菌粒颗粒产生的问题是这些噬菌体和噬菌体衍生的颗粒通常在大多数条件下仅以长丝形式获得。特别地，ff噬菌体或噬菌粒颗粒的高长径比干扰了依赖于扩散的应用，例如侧流诊断或分析物检测装置。

7、据报道，通过从第一个(+)ori复制(+)链ssdna直到第二个(复制)(+)ori，包括在噬菌体群体中以低频率发生的ig序列的噬菌体基因组的小部分的复制导致产生两种类型的病毒样颗粒，短的(短干扰颗粒)和长的(原始噬菌体基因组)(enea等人，1977；ravetch等人，1979)。

8、(+)ori由基本部分(命名为a或i)和非基本部分(命名为b或ii)组成。完整的起点是野生型复制蛋白pii的100％活性所需的，而必要部分相对于完整的起点以1％的效率复制，除非使用对(+)ori a具有增加的亲和力的复制蛋白pii的特定突变体(dotto等人，1984b)。

9、对(+)起点功能作图的广泛研究表明，如果至少在突变ori(+)上游的相同质粒中存在完整ori(+)a结构域，则截短的(+)ori a结构域(在3'端的29个残基(δ29)已从中缺失)允许被pii(复制蛋白)切割(dotto等人，1982，1984a)。在这种排列中，完整的ori(+)用作(+)链复制的起始子，而(+)oriδ29用作终止子。当彼此相邻放置时，这两个(+)ori序列允许在起始子和终止子切割位点之间产生短的环状ssdna，并组装非常短的ff衍生的纳米棒(50nm长)，条件是所有需要的ff蛋白由辅助噬菌体提供。

10、在系统中，短ssdna和全长辅助噬菌体dna都被复制并包装成两种类型的颗粒，短(50nm)纳米棒和全长(900nm)丝状病毒(specthrie等人，1992)。通过在辅助噬菌体中在piii，小外壳蛋白和酿脓链球菌蛋白血清不透明性因子血清型22(sof22)的高亲和力纤连蛋白结合结构域(纤连蛋白结合重复序列；fnb)之间构建蛋白融合体，将产生的短纳米棒进一步官能化，以允许fnb在纳米棒的表面上显示。将显示fnb的纯化的50nm颗粒用于侧流(浸量尺)测定以检测纤连蛋白，并且显示与显示fnb的相同外壳蛋白组成的900nm长的全长噬菌体颗粒相比，显示更清晰的信号(sattar等人，2015)。

11、然而，如上概述产生的纳米棒难以从也产生的全长辅助噬菌体纯化，导致包括可变大小纳米棒的纳米棒制剂，包括高水平的全长病毒体污染。另外，除去全长辅助噬菌体(大多数产生的颗粒)所需的步骤导致纳米棒的低最终产率，增加了生产和纯化的显著成本。此外，在上述系统中，每个细胞产生的环状ssdna拷贝的总数是有限的，复制效率也是如此。

12、使用ff噬菌体和噬菌粒载体产生用于诊断和/或医学应用的细丝、棒和/或颗粒的另一个问题涉及用作包括这些表达载体的转化细胞的可选择标记的抗生素抗性基因在细丝、棒和/或颗粒中的保留。

13、具体地，模板质粒重组可导致完整模板质粒的复制和包装。在典型的纯化纳米棒样本中，这可导致携带抗生素抗性基因(以1/106频率)的较长颗粒的污染。考虑到在典型的接种程序中使用的颗粒的数目(例如，每只小鼠1012个)，编码抗生素抗性的基因序列的这种污染水平是不可耐受的，因为它可能导致每次注射106个含有ampr基因的感染性颗粒。

14、基于对丝状噬菌体感染过程的了解，包括在ff噬菌体和噬菌粒颗粒中的抗生素抗性基因可以转移到肠道内或环境中的其它细菌中，传播抗生素抗性基因(russel等人，1988)。此外，来自噬菌体或噬菌粒丝状体的dna已经显示被内化到哺乳动物细胞中，导致由其dna编码的基因的表达，其包括抗生素抗性(burg等人，2002；larocca和baird，2001)。

15、因此，本发明的一个目的是通过提供一种用于生产用于各种医学和诊断方法(包括需要将纳米棒直接引入到对象中的医学应用)的可缩放生物纳米棒的系统，至少以某种方式解决上述现有技术中的缺陷。其中可缩放的纳米棒可以由ff噬菌体颗粒和/或ff噬菌体来源的颗粒以相对高的产率和/或相对低的来自较长的ff噬菌体或ff噬菌体来源的丝的污染产生，和/或其中产生的纳米棒不含或基本上不含抗生素抗性基因，和/或将至少向公众提供有用的选择。

16、在本说明书中，参考了专利说明书，其它外部文件或其它信息源，这通常是为了提供用于讨论本发明特征的上下文。除非另外明确说明，否则对此类外部文献的引用不应被解释为承认此类文献或此类信息源在任何管辖范围内是现有技术或形成本领域公知常识的一部分。

技术实现思路

1、本文公开了无病毒纳米棒生产系统(nps)。所公开的nps是指导噬菌体来源的短可缩放dna-蛋白纳米棒的表达和组装的单质粒或双质粒系统。由本文公开的nps产生的纳米棒不是噬菌体。由本文所述的nps产生的纳米棒具有40nm的最小长度(图1)，不具有感染性，不携带抗生素抗性基因并且不能在易感宿主中复制，因为它们不编码复制和病毒体组装所需的噬菌体蛋白。此外，本文所公开的nps经设计以控制所产生的纳米棒的量和长度，以及允许所属领域的技术人员产生用于特定和正交重组，酶促和化学修饰的一系列纳米棒变体。

2、因此，在第一方面，本发明涉及包括单个核酸表达构建体的纳米棒生产系统(nps)，构建体包括

3、bsfnano复制组装盒

4、至少一种营养缺陷型标记，

5、至少一个诱导型启动子，其与编码至少一种ff噬菌体蛋白的核酸序列可操作地连接，和

6、至少一个不位于bsfnano复制组装盒中的质粒复制起点。

7、在第二方面，本发明涉及纳米棒生产系统(nps)，其包括：

8、i)核酸复制构建体，其包括

9、bsfnano复制组装盒，

10、至少一种营养缺陷型标记，和

11、至少一个不位于所述bsfnano复制组装盒中的质粒复制起点，和

12、ii)辅助核酸表达构建体，其包括

13、至少一个选择标记

14、至少一个诱导型启动子，其可操作地连接于编码至少一种修饰的噬菌体编码的ff蛋白的核酸序列。

15、如上所述的本发明的不同方面的各种实施例也在以下本发明的详细描述中阐述，但本发明不限于此。本发明的其它方面可以从以下仅通过示例并参考附图给出的描述中变得明显。