通过遗传修饰的真菌微生物从简单碳源生产糖苷酶的制作方法

本发明涉及用于在简单碳源存在下生产糖苷酶(ec 3.2.1)的遗传修饰的真菌微生物，以及生产糖苷酶(ec 3.2.1)的方法。

背景技术：

1、酶在工业上已被长期用于各种领域的多种应用，如农业食品、造纸、纺织、生物燃料和洗涤剂生产等。它们特别广泛地用于动物营养，其中它们弥补动物体内能够水解特定化学键或降解某些复杂底物的酶的缺乏或不足。因此，它们可以释放易于被动物吸收的分子或有益于其消化健康的分子；解构复杂的分子网，从而提高动物内源性酶对营养的可及性；降解饲料中所含的抗营养因子，从而限制其作用；降解可溶性多糖从而降低消化团(digestive bolus)的粘度，并最终提高饲料的消化率。

2、除了植酸酶和蛋白酶之外，糖苷酶(也称为糖苷水解酶或糖基水解酶)是主要用于动物饲料的酶类之一。它们催化复杂糖中存在的糖苷键的水解，即高分子量大分子，如纤维素、半纤维素、果胶和淀粉。

3、糖苷酶组包含木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶和果胶酶。

4、内切-β-1,4-木聚糖酶或木聚糖酶(ec 3.2.1.8)主要负责水解存在于木聚糖主链中的β-1,4键，木聚糖是自然界中非常丰富的非淀粉多糖，是存在于植物细胞壁中的半纤维素的主要成分。换句话说，它们催化木聚糖中(1→4)-β-d-木糖苷键的水解以释放寡糖。

5、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶(ec 3.2.1.55)是参与l-阿拉伯糖键水解的酶。特别地，它们催化多种寡糖和多糖的非还原性末端残基α-l-1,2-、α-l-1,3-和α-l-1,5-阿拉伯呋喃糖基的水解，这些寡糖和多糖的阿拉伯木聚糖是植物细胞壁的主要成分，从而释放阿拉伯糖分子并促进木聚糖酶接近木聚糖主链。

6、糖苷酶(特别是木聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶)是降解半纤维素的必需酶，半纤维素是植物细胞壁的主要成分之一。然而，哺乳动物不能产生这些酶，或者至少不能产生足以用于有效水解的量。由于用于动物营养的饮食富含植物纤维，因此在饲料中提供外源糖苷酶通常是有利的，特别是对于家畜，以便优化动物对饲料纤维部分的利用，并从而提高这些家畜的生长性能。

7、糖苷酶可由许多生物体天然产生，如植物、藻类、腹足类、节肢动物、酵母、真菌、细菌和原生动物。它们的产生水平将取决于编码这些蛋白质的基因的表达水平，表达由激活和抑制机制非常精确地控制，这些机制尤其依赖于它们环境中存在的碳源。特别是，简单碳源(如葡萄糖、蔗糖或甘油)的存在将触发分解代谢物抑制机制(adnan等人，2017；galinier，2018)。这种机制在微生物中高度保守，允许它们通过防止它们在给定条件下合成多余的蛋白质来节省能量。换句话说，这种现象允许微生物优先使用某些碳源。当简单碳源不再可用时，并且因此当分解代谢物抑制被解除时，非优先碳源(如复杂碳源)将触发机制以诱导产生参与其降解和分解代谢的酶，从而允许它们被微生物利用。例如，真菌将在第一阶段首先通过吸收可快速代谢的碳源来生长，然后在第二阶段通过吸收非优先碳源来生长。

8、基因表达的抑制和诱导机制涉及许多转录因子，即与基因上游的调控序列和rna聚合酶相互作用的必需蛋白质。这些转录因子的激活或抑制本身依赖于微生物所处的环境，特别是存在的碳源。

9、在丝状真菌中，多种转录因子(如xlnr、arar、clra、clrb、manr和araa)已被描述为编码糖苷酶的基因表达的正调节子，而crea和acei是主要的已鉴定的负调节子。

10、在工业规模上，酶主要是通过所谓的分批、补料分批或连续方法，在固体或液体培养基中，在合适的底物存在下通过微生物发酵来生产的。在这些微生物中，丝状真菌特别适应于分泌大量的酶(2019)。这种生产的主要挑战之一是它在经济上是有利可图的。因此，使用便宜且易于使用的碳源是有利的，例如那些可溶形式的碳源，如葡萄糖和蔗糖或甘油。然而，这些碳源在大多数生物体中诱导具有抑制基因表达效果的分解代谢物抑制机制，特别是那些编码糖苷酶如纤维素酶和半纤维素酶的基因。

11、通常提供的方案是允许在简单碳源存在下生产酶，即对生产菌株进行遗传修饰，以使分解代谢物抑制机制失活。一般来说，这由以下组成：使转录因子crea(分解代谢物抑制的主要元件)失活，或使相应编码基因的表达失活。然而，研究表明crea基因的完全和/或部分缺失会引发有害效果，例如构巢曲霉(aspergillus nidulans)中生存力的严重降低或菌落形态的改变、里氏木霉(trichoderma reesei)中气生菌丝和孢子形成的发展。因此，()crea蛋白的特定区域似乎是生长所必需的，所述crea蛋白是在真菌(曲霉属(aspergillus)、木霉属(trichoderma)的不同种)中高度保守的蛋白，确立了crea在氨基酸转运和氮吸收中的重要作用。

12、从上文可以清楚地看出，显然需要开发新的技术方案，以允许糖苷酶的有效生产，特别是在工业规模上，而不具有现有技术的缺点，例如生产成本高、耗时长和/或依赖于培养基中合适碳源的存在。

技术实现思路

1、发明人出乎意料和令人惊讶地开发了遗传修饰的微生物，特别是遗传修饰的丝状真菌，与亲本微生物或现有技术的微生物相比，其具有增加的从简单碳源产生参与降解复杂碳源的酶(如糖苷酶(ec 3.2.1))的能力且独立于分解代谢物抑制机制。

2、本发明的目的是使用遗传修饰的微生物，特别是真菌微生物，从简单的碳源生产高滴度的糖苷酶，特别是半纤维素酶，特别是木聚糖酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶。

3、因此，本发明涉及用于在简单碳源存在下生产糖苷酶(ec 3.2.1)的遗传修饰的真菌微生物，其基因组的修饰包含以下基因的表达的失活、改变或缺失，有利地，由以下基因的表达的失活、改变或缺失组成：

4、-由序列seq id no:1所示的核苷酸序列组成的基因；

5、-编码序列seq id no:2所示的肽序列的核苷酸序列；或者

6、-与序列seq id no:2的肽序列具有至少65％或甚至70％、75％、80％、85％、90％、95％或甚至99％同一性的序列。

7、这种修饰导致不产生相应的蛋白质，或产生无功能的蛋白质，或产生截短的因而无功能的蛋白质。

8、根据本发明或在根据本发明的用途或方法中实施的遗传修饰的真菌微生物被遗传修饰以避开真菌微生物(例如在丝状真菌中)中天然存在的分解代谢物抑制机制，根据该机制，如果培养基中存在简单碳源如葡萄糖，则微生物通过停止参与更复杂底物降解的酶(如糖苷酶)的合成来“保存其强度”。

9、根据本发明，所述真菌微生物天然不具有从简单碳源生产糖苷酶的能力，并且所进行的遗传修饰旨在赋予其这种能力。

10、因此，本发明具有多种优点，特别是：

11、-在不改变微生物的生存力和形态的情况下，生产用于喂养动物，特别是家畜的酶的工业利益；

12、-通过使用廉价且可溶的简单碳源的经济利益；

13、-通过微生物以工业产量有效地生物生产糖苷酶。

14、在本发明的上下文中，表述“遗传修饰的微生物”是指根据本发明的微生物在自然界中没有发现，并且通过引入新的遗传元件和/或通过缺失和/或修饰微生物的内源性遗传元件而被修饰。这种修饰可以通过基因组编辑技术、体内进化、基因组重组、定点或随机诱变或本领域技术人员已知的任何其他菌株工程技术来产生。

15、在本发明的上下文中，术语“失活”、“改变”和“缺失”可互换使用，指不产生相应的蛋白质或产生相应的无功能蛋白质，其通过以下方式获得：例如，通过实施对应于转录基因沉默或转录后基因沉默的基因沉默技术，通过将突变引入到控制编码所述蛋白质的基因表达的启动子序列中和/或引入到编码所述蛋白质的序列中，通过移动阅读框导致早期终止密码子引入到编码蛋白质的序列中，或通过缺失编码控制编码所述蛋白质的基因表达的启动子的基因和/或编码所述蛋白质的基因。

16、出于本发明的目的，术语“同一的”和“同源的”可互换使用，是指两种多肽之间的序列同一性。当被比较的两个序列的每一个中的某个位置被相同的氨基酸单体亚基占据时，那么这两个分子在该位置是同源的或同一的。两个序列之间的同一性百分比是两个序列共有的相应位置数量的函数，并且是该数量除以被比较的位置数量并乘以100。例如，如果两个配对序列中10个位置中有6个是同一的，那么这两个序列是60％同一的。通常，通过比对两个序列来进行比较，以产生最大的同源性/同一性。

17、术语“编码”或“为…编码”可互换使用，是指多核苷酸(如基因、cdna或mrna)中特定核苷酸序列的固有性质，以用作合成具有确定氨基酸序列的其它聚合物的模板,以及由此产生的生物学性质。因此，如果一个基因对应的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。核苷酸序列与mrna序列是同一的且通常在序列表和数据库中描述的编码链和用作基因或cdna转录模板的非编码链都可被称为编码该基因或cdna的蛋白质或其它产物。

18、在本发明的上下文中，表述“简单碳源”是指提供产生根据本发明的酶所必需的碳的营养物。这种所谓的“简单”碳源是小尺寸和低分子量的分子，也就是说分子量小于或等于500g/mol，如单糖、二糖或多元醇。根据本发明，“简单碳源”与“复杂碳源”相反，“复杂碳源”对应于大尺寸和较高分子量的分子，也就是说分子量大于500g/mol。

19、在本发明的上下文中，表述“诱导底物”是指用于生产根据本发明的酶的诱导碳源。此外，这种诱导碳源不是生产所述酶的全部碳源。

20、优选地，本发明的主题是如所定义的用于在简单碳源存在下生产糖苷酶(ec3.2.1)的遗传修饰的真菌微生物，其单独或组合具有以下技术特征：

21、-所述真菌微生物选自子囊菌纲(ascomycetes)；

22、-所述真菌微生物选自由散囊菌纲(eurotiomycetes)或粪壳菌纲(sordariomycetes)组成的组；

23、-所述真菌微生物选自由发菌科(trichocomaceae)、曲霉菌科(aspergillaceae)或肉座菌科(hypocreaceae)组成的组；

24、-所述真菌微生物选自由篮状菌属(talaromyces)、曲霉属、木霉属或青霉属(penicillium)组成的组；

25、-所述真菌微生物选自由多样篮状菌(talaromyces versatilis)、纤维素降解篮状菌(talaromyces cellulolyticus)、黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillusoryzae)、构巢曲霉、里氏木霉或产黄青霉(penicillium chrysogenum)组成的组；

26、-所述真菌微生物是丝状真菌；

27、-所述真菌微生物是多样篮状菌；

28、-所述真菌微生物具有“野生的”基因型，也就是说它是天然/参照形式的微生物，其由在给定基因座存在的标准等位基因组成；

29、-所述真菌微生物具有“突变的”或“突变体”基因型，也就是说它是一种不处于其天然/参照形式的微生物，其由在给定基因座存在不同于标准等位基因的等位基因组成。

30、根据本发明的遗传修饰的真菌微生物能够在简单碳源存在下生长，简单碳源有利地作为唯一碳源。根据本发明的简单碳源包括(有利地，由以下组成)：单糖和/或二糖和/或多元醇，优选葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油或它们的混合物，更优选葡萄糖。

31、根据本发明的真菌微生物基因组的修饰出乎意料地能够在通常被称为分解代谢物抑制机制的激活剂的简单碳源存在下，诱导参与复杂糖降解的酶的产生，例如糖苷酶(ec3.2.1)，特别是半纤维素酶，特别是木聚糖酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶。

32、本发明的遗传修饰的真菌微生物在被称为“诱导底物”的第二种简单或复杂底物存在下诱导糖苷酶(ec 3.2.1)的产生(该诱导底物不同于本发明意义上的简单碳源，特别是在有关本发明微生物生长的功能和/或活性方面)，例如木糖、低聚木糖、木聚糖、半纤维素、纤维素或其混合物，所述诱导底物以小比例存在于培养基中，即比例低于简单碳源的比例。有利地，诱导底物的比例在被本发明的微生物消耗后不会在培养基中更新。

33、为了获得良好的酶生产力，有必要为根据本发明的遗传修饰的真菌微生物的生长提供可快速吸收的碳源(即简单的碳源，特别是可溶性的，例如葡萄糖和/或蔗糖)和诱导底物(例如木糖)，其允许根据本发明的糖苷酶的表达和分泌到培养基中。

34、根据本发明的遗传修饰的真菌微生物，特别是丝状真菌，可以通过在固体或液体培养基中的需氧发酵来生产糖苷酶(ec 3.2.1)。

35、根据本发明的生产糖苷酶的方法包含以下步骤：

36、(a)制备培养基，所述培养基含有如上所述的至少一种简单碳源、用于生产糖苷酶的诱导底物、至少一种氮源以及用于生产生物质和蛋白质的本发明真菌微生物生长所必需的所有矿物质和营养物；

37、(b)用根据本发明的遗传修饰的真菌微生物菌株接种发酵培养基；

38、(c)控制和维持发酵培养基的温度在25℃和34℃之间的数值，发酵培养基的ph值在3.5和5之间的数值，并且氧分压(po2)大于30％；以及

39、(d)通过供应简单碳源进行发酵至少12小时，有利地至少24小时，或甚至至少48小时或至少72小时，优选地至少96小时，优选地12小时至300小时，特别地24小时至300小时。

40、优选地，本发明的主题是生产如上定义的糖苷酶(ec 3.2.1)的方法，其单独或组合具有以下技术特征：

41、–所述糖苷酶(ec 3.2.1)是半纤维素酶，特别是木聚糖酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶

42、-所述简单碳源包含单糖和/或二糖和/或多元醇，优选葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油或其混合物，更优选葡萄糖；

43、-所述简单碳源由单糖和/或二糖和/或多元醇组成，优选葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油或其混合物，更优选葡萄糖；

44、-所述诱导底物选自由木糖、木糖聚合物、纤维素、半纤维素、木聚糖及其混合物组成的组；

45、-在所述培养基中，简单碳源的浓度大于诱导底物的浓度；

46、-在所述培养基中，简单碳源的浓度等于诱导底物的浓度；

47、-在所述培养基中，简单碳源的浓度严格大于诱导底物的浓度；

48、-所述培养基中包含的简单碳源的浓度为10-60g/l培养基，优选10-30g/l；

49、-所述培养基中包含的诱导底物的浓度为5-60g/l培养基，优选5-30g/l；

50、-所述至少一种氮源是例如硫酸铵、磷酸铵或它们的混合物；

51、-所述培养基中包含的所述至少一种氮源的浓度为例如培养基总质量的0.1-5％，有利地为培养基总质量的0.1-2％；

52、-根据步骤(a)的培养基中包含的所述矿物质是例如硫酸铵，有利地其浓度为培养基总质量的0.5％至3％；磷酸钾；氯化钙；硫酸镁；硫酸铜；硫酸铁；硫酸锰；硫酸锌及其混合物；

53、-根据步骤(a)的培养基中包含的所述营养物是例如细胞生长因子；

54、-根据步骤(d)的供应简单碳源是以连续、半连续或分批方式进行；并且

55、-本发明的方法还包含步骤(e)，其旨在回收含有糖苷酶的培养物上清液，所述回收是连续或非连续的提取；

56、-本发明的方法还包含通过离心或超滤进行的步骤(e)。