一种自组装多肽RAKA16的合成方法与流程

本发明属于有机合成领域，尤其涉及一种自组装多肽raka 16的固相合成方法。

背景技术：

1、 自组装多肽可以利用氢键、疏水作用、π-π堆积作用等非共价键力自组装成形态与结构特异的组装体，且由于多肽具有良好的生物相容性和可控的降解性能，因此被广泛应用于3d打印、细胞储存，组织工程支架等研究领域。其中raka 16已被开发为止血剂和水凝胶敷料等医疗产品。

2、 raka 16的肽序为：

3、ac- arg-ala-asp-ala-glu-ala-lys-ala-arg-ala-asp-ala-glu-ala-lys-ala-nh

4、自组装多肽raka 16的合成，一般采用逐步偶联的方式。将16位至1位的保护氨基酸通过脱保护和偶联的方式依次连接在氨基酸树脂上。由于受多肽二级结构的影响，在连接至第9位arg和第1位arg时，反应位点的空间位阻变大，偶联反应困难，容易产生较多的缺失杂质，影响合成收率并且提高了纯化难度。

5、 综上，现有合成raka 16的方法，合成周期较长，且容易引入一些难以去除的缺失肽和消旋肽，并且影响收率。

技术实现思路

1、本发明提出一种自组装多肽raka 16的合成方法，其目的在于解决现有合成raka16的方法，合成周期长，且容易引入一些难以去除的缺失肽和消旋肽，并且影响收率的问题。

2、技术方案：

3、本发明提出一种自组装多肽raka 16的固相合成方法，包括以下步骤：

4、s1、制备x1全保护片段，x1全保护片段为fmoc-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-oh；

5、s2、制备x2全保护片段，x2全保护片段为fmoc-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-oh；

6、s3、先用脱保护试剂脱除rink resin的fmoc保护基，再用缩合试剂将x1全保护片段和x2全保护片段依次间隔偶联在rink resin上，得x1-x2-x1-x2-rink resin，即fmoc-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala- glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala -rink resin；

7、s4、x1-x2-x1-x2-rink resin用脱保护试剂脱除fmoc保护基，再用乙酸酐和吡啶混合溶液进行n端的乙酰化，得到ac- arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala -rink resin；

8、s5、裂解ac- arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala -rink resin，裂解反应液经过滤，沉降得到的固体粗肽，固体粗肽通过乙醚重复洗涤离心2~5次，得到洗涤后的粗肽，将粗肽干燥至不再减重，得到ac- arg-ala-asp-ala-glu-ala-lys-ala-arg-ala-asp-ala-glu-ala-lys-ala-nh2粗品；

9、s6、将粗品经hplc提纯，冻干后得ac- arg-ala-asp-ala-glu-ala-lys-ala-arg-ala-asp-ala-glu-ala-lys-ala-nh2精肽的冻干粉末。

10、 进一步的，所述rink resin的替代度为0.2~0.8mmol/g。

11、 进一步的，步骤s4中脱除fmoc保护基的x1-x2-x1-x2-rink resin与乙酸酐和吡啶的摩尔比为1：(5~20)：(5~20)。

12、 进一步的，步骤s5中所述粗品经hplc提纯之前，需用n-甲基吡咯烷酮或dmf溶解粗品，至粗品的浓度为0.5 ~1mmol/l。

13、优选的，所述x1全保护片段的制备步骤如下：

14、1a、制备fmoc- ala-ctc resin：向溶胀后的2-ctc rsein中加入fmoc-ala-oh和有机碱，得到fmoc-ala- ctc resin；

15、1b、fmoc-ala- ctc resin采用逐步偶联的方式，先用脱保护试剂脱除fmoc保护基，再用缩合试剂依次偶联氨基酸原料fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ala-oh和fmoc-arg(pbf)-oh，得到fmoc-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-ctc resin；

16、1c、采用全保护裂解的方式裂解fmoc-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-ctc resin，得到x1全保护片段，即fmoc-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-oh；

17、所述x2全保护片段的制备步骤如下：

18、2a、向溶胀后的2-ctc rsein中加入fmoc-ala-oh和有机碱，得到fmoc-ala- ctcresin；

19、2b、fmoc-ala- ctc resin采用逐步偶联的方式，先用脱保护试剂脱除fmoc保护基，再用缩合试剂依次偶联氨基酸原料fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ala-oh和fmoc-glu(otbu)-oh，得到fmoc- glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala -ctc resin；

20、2c、采用全保护裂解的方式裂解fmoc-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-ctc resin，得x2全保护片段，即fmoc- glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-oh。

21、 优选的，步骤1a和2a中所述的有机碱为dipea，且有机碱与2-ctc rsein、fmoc-ala-oh的摩尔比为（2~10）：1：（1~5）。

22、优选的，所述全保护裂解试剂为tfe的二氯甲烷溶液，tfe与二氯甲烷体积比为（10~25）：（75~90）；全保护裂解试剂用量为1g肽树脂/10ml全保护裂解试剂。

23、优选的，所述缩合试剂为等摩尔比的dic和hobt的混合液，或者等摩尔比的pybop和diea和hobt的混合液；或者等摩尔比的hbtu和diea和hobt的混合液；

24、在步骤s3中缩合试剂、rink resin、x1全保护片段或者x2全保护片段的摩尔比为（4.8~12）：1：（2~5）；

25、在步骤1b和2b中缩合试剂、fmoc-ala- ctc resin、氨基酸原料的摩尔比为（4.8~12）：1：（2~5）。

26、优选的，所述脱保护试剂为哌啶和dmf的混合溶液，二者体积比为哌啶：dmf=1：4；脱保护试剂的用量为1g肽树脂/（10-20）ml脱保护试剂。

27、优选的，所述裂解的裂解液为三氟乙酸溶液，其中三氟乙酸的体积占比为85%~95%；裂解时间为2~4h，裂解温度为25~45℃；裂解液用量为1g肽树脂/10ml裂解液。

28、本发明具有以下优点：

29、本发明通过合成全保护片段fmoc-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-oh和fmoc- glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-oh，再通过逐步偶联的方式，用缩合试剂将片段依次偶联在rink resin（树脂）上，得到fmoc-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-arg(pbf)-ala-asp(otbu)-ala-glu(otbu)-ala-lys(boc)-ala-rink resin。经过fmoc基团脱除，乙酰化反应，肽树脂收缩，肽树脂裂解，粗肽纯化，得到raka 16精肽。常规逐步偶联的合成周期为14天，总收率约为10%，本发明缩短了合成周期，约为8天，提高了收率，总收率在20%以上。

30、 本发明用片段法合成raka 16，这种方式规避了中长肽因二级结构影响导致的偶联困难的情形，缩短了合成的周期，简化了合成的操作，提高了合成效率。同时有效地减少了缺失肽和消旋肽的产生，从而降低了纯化的难度，具有广泛的应用前景。