一种基于点击化学技术制备N-乙酰半乳糖胺寡聚核苷酸偶联物的方法与流程

本发明属于化学生物医药，特别是涉及一种基于点击化学技术制备n-乙酰半乳糖胺寡聚核苷酸偶联物的方法。

背景技术：

1、随着科学技术的不断进步，核酸药物作为一种新颖而有潜力的方法备受关注。核酸药物的应用范围广泛，可以用于各种疾病，包括癌症、遗传性疾病、传染病等。然而，核酸药物的本身存在着稳定性差、免疫原性高以及细胞摄取效率低等问题，制约了其在医学应用中的发展。为了克服这些挑战，研究人员开始着眼于核酸药物的递送系统。

2、核酸药物递送系统是指用于将核酸药物传递到靶细胞内的一种技术。早期的研究主要使用病毒作为递送核酸的载体，包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒等。然而，使用病毒作为载体存在一些不良特性，例如潜在的致癌性和高免疫原性，这限制了其在医学应用中的进展。因此，研究人员开始寻找其他替代的递送系统。

3、n-乙酰半乳糖胺(n-acetylgalactosamine，简称galnac)寡聚核苷酸偶联修饰是现有技术中较为常用的核酸药物递送系统之一，galnac基于rna干扰技术得到的n-乙酰半乳糖胺寡聚核苷酸偶联物(简称galnac-sirna偶联物)是一种寡聚核苷酸类药物，具有广泛的医药应用前景。

4、rna干扰是一种通过特定的小rna分子抑制基因表达的机制。sirna(smallinterfering rna)是一类由双链rna分子组成的短片段，通常由20到25个核酸碱基组成。当sirna进入细胞内时，它可以与rna诱导沉默复合物(risc)相互作用，并将其中一个链条(主导链)导入到risc中。然后，risc可以识别并与主导链相互匹配的特定mrna序列结合，导致该mrna的降解或翻译抑制，从而达到抑制特定基因表达的效果。

5、galnac-sirna与传统的sirna相比，其特殊之处在于寡聚核苷酸分子的带电部分具有galnac修饰。这种修饰使得galnac-sirna能够选择性地结合并被肝脏细胞表面的galnac受体识别和摄取，从而增加了药物在肝脏中的富集程度。

6、由于药物在肝脏中富集，galnac-sirna在肝脏疾病的治疗中具有巨大的潜力。例如，肝炎病毒感染、遗传性代谢疾病、脂质代谢紊乱等疾病都可以通过干扰特定基因的表达来进行治疗。传统的治疗方法可能存在局限性，而galnac-sirna可以通过针对性地抑制特定的mrna而实现治疗效果。

7、现有的技术方法中，对于galnac-sirna偶联物的制备通常使用二酰亚胺偶联剂诸如dcc、dic、edci或磷鎓盐诸如pybop，需要额外使用有机碱，并且典型地常在极性无质子溶剂诸如dmf或dmso中运行，需要在液相条件下进行。然而，前述技术方法中产生的副产物较难纯化分离，且局限于液相条件下，适合实验室规模的合成而不能良好的适应于经济和商业上的大规模生产。

8、因此，本领域需要开发一种新的制备n-乙酰半乳糖胺寡聚核苷酸偶联物的方法，操作简单、经济环保、反应条件温和的同时，能够保证较好的底物转化率，稳定性高，以利于n-乙酰半乳糖胺寡聚核苷酸偶联物galnac-sirna的大规模生产。

技术实现思路

1、为解决以上技术问题，本发明提供了一种基于点击化学技术制备n-乙酰半乳糖胺寡聚核苷酸偶联物的方法，叠氮化物/炔1,3-偶极环加成(点击化学，click chemistry)为小分子和生物分子提供了简便的反应条件，已成为药物化学中生物偶联的首选方法。寻找新的、有效的合成大量类似物的策略使“点击化学”成为药物化学和药物发现领域中广泛使用的概念。铜(i)催化的叠氮化物与末端炔烃的huisgen 1,3-偶极环加成可能是应用最广泛的点击反应之一，因为它在连接两个不同分子实体方面具有高特异性和效率。

2、本发明提供一种基于点击化学技术制备n-乙酰半乳糖胺寡聚核苷酸偶联物的方法，本方法将带固载的寡聚核苷酸链与galnac片段在非均相条件中直接偶联，偶联结束后，将初产物进行切割和脱保护，得到终产物n-乙酰半乳糖胺寡聚核苷酸偶联物，所述方法包括如下步骤：

3、步骤一：在液相条件下，以式ⅷ化合物和式ⅱ化合物为底物，在铜离子催化剂的催化下，添加抗坏血酸钠作为还原剂，偶联得到式ⅳ化合物；

4、所述式ⅷ化合物的结构为：式ⅷ化合物中，基团为具有羟基或氨基功能化的聚苯乙烯载体，基团中连接有固载，基团为带有三个炔基和保护基的羟基化合物，oligo为寡聚核苷酸链，所述寡聚核苷酸链为序列长度为20～23mer，所述寡聚核苷酸链由多个亚磷酰胺单体组成；

5、所述式ⅱ化合物的结构为：式ⅱ化合物中，linker-n3为peg链，所述peg链的长度为3-5个peg分子；

6、所述式ⅳ化合物的结构为：

7、

8、步骤二：将式ⅳ化合物进行氨解，切除固载并脱去保护基，得到式ⅴ化合物n-乙酰半乳糖胺寡聚核苷酸偶联物，所述式ⅴ化合物的结构为：

9、

10、具体地，所述固载为羟基树脂或氨基树脂。

11、具体地，所述铜离子催化剂为溴化亚铜二甲硫醚络合物。

12、具体地，所述步骤一的反应过程中，从反应器的底部鼓入氮气，鼓入氮气可以使得带固载的式ⅷ化合物在液相中更好的混合。

13、具体地，所述亚磷酰胺单体选自以下8种亚磷酰胺单体，分别为：cas号为110782-31-5的n6-苯甲酰基-5'-odmt-2'-ome-腺嘌呤核糖亚磷酰胺、cas号为199593-09-4的n4-乙酰基-5'-odmt-2'-ome-胞嘧啶亚磷酰胺、cas号为150780-67-9的n2-异丁酰基-5'-odmt-2'-ome-鸟嘌呤核糖亚磷酰胺、cas号为110764-79-9的5'-o-dmt-2'-ome-尿嘧啶核糖亚磷酰胺、cas号为136834-22-5的n6-苯甲酰基-5'-odmt-2'-氟-腺嘌呤核糖亚磷酰胺、cas号为159414-99-0的n4-乙酰基-5'-odmt-2'-氟-胞嘧啶脱氧核糖亚磷酰胺、cas号为144089-97-4的n2-异丁酰基-5'-odmt-2'-氟-鸟嘌呤脱氧核糖亚磷酰胺和cas号为146954-75-8的5'-o-dmt-2'-氟-尿嘧啶脱氧核糖亚磷酰胺。

14、具体地，所述亚磷酰胺单体间以磷酸骨架相连。

15、具体地，式ⅷ化合物中，所述保护基为4,4'-二甲氧基三苯甲基。

16、具体地，所述步骤一中，式ⅷ化合物和式ⅱ化合物的摩尔比为1:(3～9)。

17、优选地，所述步骤一中，式ⅷ化合物和式ⅱ化合物的摩尔比为1:4、1:5、1:6、1:7或1:8。

18、具体地，所述步骤一中，铜离子催化剂与式ⅷ化合物的摩尔比为1：(3～6)。

19、优选地，所述步骤一中，铜离子催化剂与式ⅷ化合物的摩尔比为1:3.5、1:4、1:4.5、1:5或1:5.5。

20、具体地，所述步骤一中，抗坏血酸钠与式ⅷ化合物的摩尔比为1：(20～100)。

21、优选地，所述步骤一中，抗坏血酸钠与式ⅷ化合物的摩尔比为1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90。

22、具体地，所述步骤一中，反应温度为15～50℃，反应时间为1～20h。

23、优选地，所述步骤一中，反应温度为20℃、30℃或40℃，反应时间优选为1～8h，更优选为3～7h。

24、本技术中固相合成选用本领域常规技术手段，如《固相有机合成原理及应用指南》，在树脂上多次进行4步反应循环：脱保护、偶联、氧代或硫代和盖帽四个步骤，最终得到目标长链。

25、本技术的有益效果包括：

26、1、本技术提供的制备方法中，将带固载的寡聚核苷酸链与galnac片段在非均相条件中直接偶联，偶联结束后，将初产物进行切割和脱保护，得到终产物n-乙酰半乳糖胺寡聚核苷酸偶联物，能够降低杂质含量，在后处理过程中能够较好的实现产物n-乙酰半乳糖胺寡聚核苷酸偶联物与副产品的分离，方便存储的同时，进一步提升了产物收率，有利于工业扩大生产。

27、2、使用本技术提供的催化体系合成galnac-sirna偶联物，所用试剂廉价易得，且底物的转化率高，从而提升产品的收率和生产的效率，也为后续不同序列寡核苷酸的修饰方式提供了借鉴经验。

28、3、本技术提供的制备方法，操作简单，反应条件温和，成本低，产量高，关键杂质明显下降，使得产品纯度高、稳定性好，且绿色环保无污染，能够成功应用于工业化放大生产。