一种丁香假单胞菌噬菌体及其在防治茶树芽枯病中的应用

本发明涉及生物防控领域，特别是涉及一种丁香假单胞菌噬菌体及其在防治茶树芽枯病中的应用。

背景技术：

1、噬菌体(bacteriophage，phage)是一种在细胞内生长繁殖的病毒，早在1896年，hankin通过研究发现，在印度的恒河和亚穆纳河的河水中，存在一种可以通过磁性滤器的物质，其对霍乱有明显的抗菌作用。随后，edward twort和felixd herele分别在1915年和1917年各自独立发现一种物质，他们发现这一物质能够特异性裂解宿主细菌，并在双层平板上形成空斑，因此将其命名为噬菌体。自生物进化至今，环境中的噬菌体数量已达到1011。目前，海洋是噬菌体含量最高的地方，平均每毫升海水中的噬菌体的含量可高达9×108个，并且海洋中的70％的细菌都能被噬菌体感染。噬菌体是最为普遍和分布广泛的一种生物，它的传播途径多，有病原菌的地方都可以筛选到噬菌体。噬菌体安全性较高，不会对环境造成污染。噬菌体对真核生物是没有毒性的，噬菌体是一种具有有限自我复制能力的有益的病毒，它们只在有宿主细胞存在的环境中复制，在宿主细胞缺乏时快速降解，一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。噬菌体只能侵染相应的细菌，具有高度的特异性，不会破坏正常的菌群，符合现代倡导的绿色、无污染农业的要求，然而传统的农药防治在杀死致病菌的同时也对土壤中的有益微生物进行了破坏，导致土壤微生物失衡，对环境产生了不良影响。噬菌体的制备简便且绿色环保，且效价较稳定，在4℃条件下保存数月后，效价没有明显降低。因为噬菌体不受农业化学品的抑制，所以噬菌体也可以和多种农用化学品混合在一起使用而且没有明显的效价损失。噬菌体的增殖迅速，呈指数方式进行增殖，banu等发现t7噬菌体在较短时间内就可以扩增到100倍，只需要使用少量的噬菌体就可以杀灭宿主菌。与含铜杀菌剂和抗生素相比，噬菌体穿透细菌生物膜的能力强。噬菌体还可以与宿主菌发生共进化，从而克服宿主菌的抗性，而传统细菌病害防治方法不具备这样的优点。

2、丁香假单胞菌(pseudomonas syringa)是属于假单胞菌科假单胞菌属细菌，是好氧、腐生性较强的革兰氏阴性菌，具有多个致病型，在大气、土壤、水体和植物叶片等环境中普遍分布，具有较强的生态适应能力。丁香假单胞菌侵染寄主植物，通过分泌胞壁降解酶、毒素等物质破坏植物细胞的细胞壁、细胞膜等方式导致植物发病。疫病症状主要表现为溃疡、萎蔫和坏死等，是植物十大病害之首，其寄主植物最为广泛，能够引起女贞细菌性叶斑病、万寿菊细菌性叶斑病、冬青细菌性叶斑病，还可引起番茄叶斑病、菊科向日葵叶斑病、胡麻科胡麻细菌叶斑病等病害、以及茶树芽枯病。

3、丁香假单胞菌也是引起茶树芽枯病的致病病原菌，茶树芽枯病是威胁茶树生产的一种常见病害。茶树细菌性芽枯病的传播蔓延速度快、传播范围广，且常常流行成灾，是一种世界性病害。茶芽枯病(tea bud blight)主要危害幼嫩的芽叶。开始时，叶尖或叶缘部位出现黄色或黄褐色斑点，逐步扩展为不规则形病斑，病健交界处不明显。受害叶片卷缩扭曲、叶缘变脆，芽尖呈黑褐色枯焦状，严重时整个叶梢全部枯死。后期病部表面散生小黑点，大部分在叶片正面。丁香假单胞杆菌作为一种植物病原体，在感染的初期，丁香假单胞菌可以定居在叶片组织上，丁香假单胞菌可以在叶子表面存活，也可以在高湿度以及舒适的环境下存活。在有利的环境条件下，例如雨水或植物组织受伤，它会侵入植物质外体并引起疾病。部分研究表明丁香假单胞菌的某些菌株可成功进入以感染的叶子组织为食的蚜虫体内，这表明丁香假单胞菌也可以使用昆虫作为宿主。大自然中的植物不断受到病原微生物如细菌、真菌、昆虫和病毒的攻击。在漫长的进化过程中，植物逐渐形成了通过自身免疫系统来抵抗微生物侵染。微生物通过直接穿透植物表面或自然开口(例如气孔)进入植物实现侵染宿主植物。与真菌病原体不同，细菌没有专门的结构来刺穿植物表皮，它们必须依靠表面擦伤或其他自然开口来进入宿主。茶叶含有多种对人体有益的成分，如茶多酚，具有抗癌、防癌、提神、降压、保健等功效。茶叶作为我国主要的经济作物之一，茶树种植面积与茶叶年产量均居世界第一。由于其主要生长在亚热带和热带地区，生态环境稳定，温暖湿润的气候同时利于各类病菌的滋生与传播，造成茶树的病害种类众多，影响茶树的观赏价值，重则危害到茶叶的生产。

4、目前，预防茶树芽枯病的主要方法是在生产上主要采取综合防治措施减轻相关病害的发生，如喷洒化学药剂防治、选用优良的抗病品种等措施来减轻病害的发生。植物病害对全球的农业生产造成了巨大的影响，尽管化学农药的使用提高了对植物病害的控制，然而农药残留造成的环境污染，农作物上残留的化合物危害人类的健康已经到了触目惊心的地步。植物致病是一个全球性问题，植物病原菌导致的农作物病害一直是威胁人类粮食安全的重要因素，关于致病菌的致病机理值得人们的重视。早在之前，噬菌体就被看做是一种植物疾病的防控药剂，但由于噬菌体具有宿主特异性、多变的细菌敏感性以及与紫外光之间的相互作用等影响因素，所以并未受到重视。然而，现如今，在噬菌体的帮助下，减少农药的使用并防止细菌耐药性产生的生物防治再次引起了人们的注意，通过噬菌体侵染并裂解病菌的方法，将有效且安全地防止疾病发生，减少经济损失。

5、目前，噬菌体产品已有用于由黄单胞菌、丁香科假单胞菌引起的番茄和辣椒上的细菌斑点防治。obradovic等利用噬菌体应用于番茄根部施药，可以明显减少番茄细菌性叶斑病的发生。civerolo使用噬菌体处理的方法，将桃幼苗上细菌斑点的发病率降低了86％～100％。tanaka从青枯病菌(ralstonia solanacearum)中筛选出了两株噬菌体，结果表明它们都可以有效地减少烟草青枯病的发病率。flaherty等采用噬菌体防治天竺葵的白叶枯病，使天竺葵的发病率下降了70％～85％。在接下来的几年里，噬菌体被用于防治由黄单胞菌(xanthomonas)、根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)、茄科雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)引起的几种植物病害。目前，噬菌体在茶树芽枯病的防治上在国内外还未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种丁香假单胞菌噬菌体及其在防治茶树芽枯病中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过在土壤中分离筛选得到的噬菌体vb_pss_ldt325能够有效防治丁香假单胞菌引起的茶树芽枯病。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种丁香假单胞菌噬菌体(pseudomonas syringae phage)，其保藏编号为cgmcc no.45789，保藏时间为2023年11月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

4、本发明还提供所述的丁香假单胞菌噬菌体在如下(1)或(2)中的应用：

5、(1)在抑制丁香假单胞菌中的应用；

6、(2)在制备抑制丁香假单胞菌的生物菌剂或者药物中的应用。

7、本发明还提供所述的丁香假单胞菌噬菌体在如下(1)或(2)中的应用：

8、(1)在防治丁香假单胞菌引起的细菌性疾病中的应用；

9、(2)在制备防治丁香假单胞菌引起的细菌性疾病的生物菌剂或者药物中的应用。

10、优选的是，所述细菌性疾病包括茶树芽枯病。

11、本发明还提供一种抑制丁香假单胞菌的生物菌剂或者药物，含有所述的丁香假单胞菌噬菌体。

12、优选的是，所述生物菌剂或者所述药物以所述丁香假单胞菌噬菌体为有效成分，或者以所述丁香假单胞菌噬菌体为唯一的有效成分。

13、更优选的是，本发明的噬菌体可以单独或混合使用制备成生物制剂或者药物喷洒于植物表面，可特异性、大幅度地抑制植物体中丁香假单胞菌的生存和繁殖，防止植物的进一步病变。

14、更优选的是，本发明中噬菌体可以和其他的抗菌剂混合使用，在获得抗菌广谱性的同时，对茶树芽枯病菌特异性杀灭，能与该发明中噬菌体联合使用的抗菌剂包括但不限于抗生素和化学抗菌剂。本发明中噬菌体还可应用于工业生产，可由宿主菌茶树芽枯病菌特异性扩增，可应用标准病毒纯化方法高度纯化，单独使用作为植物抗菌剂防止植物中茶树芽枯病菌侵染。

15、本发明公开了以下技术效果：

16、本发明中从自然界土壤中分离得到一种烈性噬菌体分离物，该噬菌体分离物包括一种或者多种对茶树芽枯病菌具有裂解作用的噬菌体，经纯化后获取一株对茶树芽枯病菌具有烈性裂解作用的噬菌体单体即噬菌体vb_pss_ldt325，其对茶树芽枯病菌均有广谱的杀菌能力。经实验，发现该噬菌体对丁香假单胞菌所引起的茶树叶枯病具有很好的防治效果，并且对温度及ph的适用范围广，非常适用于实际生产需要。因此，本发明分离得到的噬菌体经过高度纯化有望开发成生物农药，避免茶树间丁香假单胞菌的传播以及茶树中丁香假单胞菌的生长繁殖，有效防治丁香假单胞菌引起的茶树芽枯病。