一种含二十碳五烯酸乙酯的组合物及其制备方法与应用与流程

本发明涉及生物化工领域，具体而言，涉及一种含二十碳五烯酸乙酯的组合物及其制备方法与应用。

背景技术：

1、随着人们越来越关注自身的健康，大众开始更多的摄取营养健康膳食补充剂，多不饱和脂肪酸(pufa)类产品在其中占有重要的地位。多不饱和脂肪酸是指含两个或两个以上双键且碳链长度为18-22个碳原子的直链脂肪酸，是机体代谢，特别是婴幼儿大脑发育等活动中的重要物质基础，是细胞膜的构成成分，主要起到保持细胞膜流动性，促使胆固醇酯化，降低胆固醇和甘油三酯，降低血液粘稠度，改善血液循环等生理功能，同时还具备改善人类思维和增强记忆力等作用。而人体自身无法合成多不饱和脂肪酸(pufa)物质，必须通过饮食等进行摄取获得。

2、多不饱和脂肪酸(pufa)种类繁多，主要包括ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3pufa)、ω-6多不饱和脂肪酸(ω-6pufa)、ω-9多不饱和脂肪酸(ω-9pufa)等形式，如α-亚麻酸(ala)、二十碳五烯酯(epa)、二十一碳五烯酸(hpa)、二十二碳六烯酸(dha)、二十二碳五烯酸(dpa)、亚油酸(la)、共轭亚油酸(cla)，γ-亚麻酸(gla)、花生四烯酸(aa)等，其中，尤以二十碳五烯酸(epa)和二十二碳六烯酸(dha)为主要代表的ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3pufa)最为大众所熟知和接受，它们和低脂饮食一起可用于降低高甘油三酯血症。

3、通常情况下，可从各种海产品原材料中通过压榨、萃取等手段获得含量约30％左右的鱼油粗品(称之为粗鱼油或毛鱼油)，其中epa和dha通常以甘油三酯的形式存在，少量以蜡酯和磷脂质的形式存在。由于甘油三酯的长链上还连有其他的脂肪酸分子，以甘油三酯的形式进行纯化时很难得到某种特定的含量较高的组分。因此，在分离纯化前常常将其进行乙酯化处理，转化成二十碳五烯酸乙酯(epa-ee)和二十二碳六烯酸乙酯(dha-ee)的形式，使活性成分分离出来(称之为乙酯化)，再通过一系列的手段，得到epa和dha总含量在70％以上的粗品(称之为初提)。而epa和dha对人体的作用机理互不相同且相互影响，因此往往需要将两者进一步分离以获得某种特定脂肪酸含量较高的产品。为此，需要在精制过程中进一步提高epa或dha的含量，使其达到90％以上(称之为高纯度提取)。

4、美国amarin公司研制的用于治疗高甘油三酯血症和血脂异常症的药物，就是采用纯度大于96.5％的二十碳五烯酸乙酯(epa-ee)，是美国治疗高甘油三酯血症和血脂异常症的欧米伽-3-酸乙酯处方药，具有良好的疗效。

5、高纯度的二十碳五烯酸乙酯原料药主要通过纯化乙酯型鱼油得到，目前从低含量的乙酯型鱼油中分离纯化epa-ee原料药的方法主要包括以下几种的组合：尿素包合法、低温冷冻法、金属盐沉淀法、真空蒸馏法、超临界萃取法、高效液相色谱法和柱层析法。

6、同时，考虑到作为原料药，不仅主成分二十碳五烯酸乙酯(epa-ee)含量要大于96.5％，而且其中其它杂质成分也应满足要求。由于epa-ee等含较多双键的脂肪酸对热极度敏感，在高温下容易发生异构化、裂解、聚合等，如europena j.of lipid sci.andtech.,108(2006)589-597，以及jaocs,66(1989)1822-1830中都描述了epa-ee在受热过程中易产生其5个双键中一个或两个同时异构化为反式脂肪酸的异构体，并对这几个异构体进行了定位。

7、所以原料药epa-ee生产过程中，除了要将源自原料鱼油的除epa以外的脂肪酸乙酯等尽量去除外，而且在epa-ee的分离纯化过程中，工艺条件要尽量温和，在尽量将其它脂肪酸乙酯去除的同时，减少epa-ee异构体和其它杂质的产生。一般来说，原料药中其它已知的脂肪酸乙酯含量应小于0.50％，对于每一种未知杂质，要求其含量在0.1％以下。

8、在先前技术中，有大量研究从工艺或设备创新方面来提纯得到高纯度的二十碳五烯酸乙酯，但并未考虑到此高纯度二十碳五烯酸乙酯中杂质的去除。

9、cn102391112b公开了一种通过分子蒸馏法、盐沉淀法、制备色谱法生产高纯度epa-ee的方法，得到的epa-ee含量在96％以上，但对其中的其它脂肪酸杂质没有关注。

10、cn106795452a中公布了一种通过控制精馏塔真空度和温度，结合制备色谱法得到epa-ee，其主要目的是控制epa-ee中异构体的产生，以及尽量去除花生四烯酸乙酯(aa)，而对其它如相对于epa-ee保留时间为0.613，0.836，0.966等的未知杂质峰没有进行控制，而在药品级原料中，这些未知杂质的含量有严格的要求。

11、总的来说，先前制备得到的高含量二十碳五烯酸乙酯组合及其制备技术存在几方面的缺陷：或者只是注意到将二十碳五烯酸乙酯(epa-ee)含量提高到96％以上，而对其中的杂质没有关注；或者只是关注到epa-ee的异构体杂质，对其它脂肪酸杂质或未知杂质没有控制，这样的产品不适于作为原料药应用。

12、另外，原料药二十碳五烯酸乙酯是天然来源，其杂质种类及杂质水平随着鱼类来自不同的捕捞区域会有较大的不同，如以秘鲁来源的毛鱼油为原料，利用先前工艺生产药品级二十碳五烯酯乙酯，有部分杂质峰很难去除至理想水平，特别是相对保留时间为0.613，0.728，0.836，0.858，0.868，0.966的这几个未知杂质通过常规工艺较难去除。

13、针对先前技术上的缺陷和天然原料产地导致的组成上的差异，有必要找到一种能高效率、适于工业化生产，适于应用不同产地鱼油来制备二十碳五烯酸乙酯的工艺，不仅能尽量减少工艺过程中的杂质的产生，而且能有效地去除除epa-ee外其它脂肪酸乙酯如硬脂酸乙酯(sda-ee)、花生四烯酸乙酯(aa-ee)、二十碳四烯酸乙酯(eta-ee)、二十二碳六烯酸乙酯(dha-ee)、二十二碳五烯酸乙酯(dpa-ee)、二十碳五烯酸乙酯(hpa-ee)等杂质，以及其它未经鉴定的未知杂质，特别是相对保留时间为0.613，0.728，0.836，0.858，0.868，0.966的这几个未知杂质，从而使生产出的epa-ee能满足食品级原料的要求。

技术实现思路

1、本发明的主要目的在于提供一种含二十碳五烯酸乙酯的组合物及其制备方法与应用，以解决现有技术中以鱼油制备的含二十碳五烯酸乙酯的组合物中杂质含量较高，尤其是相对于二十碳五烯酸乙酯，保留时间为0.613，0.728，0.836，0.858，0.868，0.966的未知杂质的含量较高的问题。

2、为了实现上述目的，根据本发明的第一方面，提供了一种含二十碳五烯酸乙酯的组合物的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

3、转酯化：将鱼油进行转酯化反应，得到脂肪酸乙酯化产物；

4、多级分子蒸馏：将脂肪酸乙酯化产物经多级分子蒸馏得到第一脂肪酸乙酯组合物，多级分子蒸馏为至少三级分子蒸馏；

5、尿素包合：对第一脂肪酸乙酯组合物进行尿素包合，得到第二脂肪酸乙酯组合物；

6、精馏：对第二脂肪酸乙酯组合物进行精馏，得到第三脂肪酸乙酯组合物；

7、制备色谱：对第三脂肪酸乙酯组合物进行制备色谱纯化，得到含二十碳五烯酸乙酯的组合物。

8、进一步地，上述尿素包合为：将第一脂肪酸乙酯组合物与脂肪醇和尿素混合，得到混合物；将混合物加热至70-80℃，保温0.5-1h，随后降温至-2-4℃结晶，过滤，得到滤液；对滤液进行水洗、脱气或使用萃取剂对滤液进行萃取，随后浓缩，得到第二脂肪酸乙酯组合物。

9、进一步地，第一脂肪酸乙酯组合物、脂肪醇、尿素的质量比为1：(4-6)：(0.8-2)；和/或，滤液与萃取剂的质量比为1：(1-2.5)；和/或，脂肪醇为乙醇或叔丁醇；和/或，萃取剂为正己烷或异辛烷。

10、进一步地，上述脂肪醇为叔丁醇；和/或，上述萃取剂为异辛烷。

11、进一步地，上述转酯化步骤包括：将鱼油溶于无水乙醇中，再加入催化剂，在75-85℃反应0.5-3h，水洗、静置分层，对上层液体进行脱气处理，得到脂肪酸乙酯化产物；和/或

12、上述多级分子蒸馏为六级分子蒸馏，六级分子蒸馏的温度为100-160℃；和/或

13、精馏条件为：塔顶真空度＜30pa，釜温160-180℃；和/或

14、制备色谱条件如下：

15、色谱柱：c18反相硅胶色谱柱；

16、流动相：甲醇和水的混合物，其中，甲醇和水的体积比为(85-95)：(5-15)；

17、上样量为填料质量的2％-15％。

18、进一步地，鱼油、无水乙醇、催化剂的质量比为1:(2-5)：(0.003-0.035)；和/或

19、催化剂为液碱质量分数25％-35％的液碱水溶液、氢氧化钾质量分数15％-25％的氢氧化钾水溶液、乙醇钠中的一种；和/或

20、水洗前，先对反应产物进行浓缩。

21、进一步地，上述六级分子蒸馏的温度依次为100-110℃、110-120℃、120-130℃、130-140℃、140-150℃、150-160℃。

22、根据本发明的第二方面，提供了一种由上述方法制备的含二十碳五烯酸乙酯的组合物，采用如下气相色谱方法检测时，以二十碳五烯酸乙酯的保留时间为1，以各组分峰的面积之和为100％，该组合物中，以面积百分含量计，

23、包含二十碳五烯酸乙酯96.5％-99.5％、相对保留时间为0.613的第一杂质＜0.07％、相对保留时间为0.836的第二杂质＜0.53％、相对保留时间为0.966的第三杂质＜0.51％、相对保留时间为0.728的第四杂质的含量＜0.5％、相对保留时间为0.858的第五杂质的含量＜0.5％、相对保留时间为0.868的第六杂质的含量＜0.5％；

24、气相色谱检测条件：

25、仪器：agilent6890；

26、色谱柱：hp-innowax，30m×0.25mm×0.25μm；

27、载气：氦气；

28、进样口温度：250℃；

29、柱温：起始170℃，保持2min，以3℃/min升温到240℃，保持7min；

30、检测器：fid，270℃；

31、进样量：1μl；

32、分流比：100：1；

33、流速：1.8ml/min；

34、进一步地，上述组合物中，二十碳五烯酸乙酯异构体面积百分含量的总和＜2％。

35、进一步地，上述组合物中，相对保留时间为0.989、1.013、1.017、1.024、1.03的物质均为二十碳五烯酸乙酯异构体。

36、进一步地，上述组合物中，以面积百分含量计，第一杂质的含量＜0.07％、第二杂质的含量＜0.53％、第三杂质的含量＜0.51％、第四杂质的含量＜0.35％、第五杂质的含量＜0.3％、第六杂质的含量＜0.3％。

37、进一步地，上述组合物中，以面积百分含量计，第一杂质的含量＜0.03％、第二杂质的含量＜0.15％、第三杂质的含量＜0.1％、第四杂质的含量＜0.1％、第五杂质的含量＜0.1％、第六杂质的含量＜0.15％。

38、进一步地，上述组合物中，以面积百分含量计，硬脂酸乙酯的含量＜1％、二十二碳五烯酸乙酯的含量＜0.1％、二十二碳六烯酸乙酯的含量＜0.1％、二十一碳五烯酸乙酯的含量＜0.3％。

39、根据本发明的第三方面，提供了一种上述含二十碳五烯酸乙酯的组合物在制备食品领域中的应用。

40、根据本发明的第四方面，提供了一种上述含二十碳五烯酸乙酯的组合物在制备药品领域中的应用。

41、应用本发明的技术方案，通过采用转酯化、多级分子蒸馏、尿素包合、精馏以及制备色谱纯化，含二十碳五烯酸乙酯的组合物中二十碳五烯酸乙酯异构体、其他脂肪酸乙酯以及相对保留时间为0.613，0.728，0.836，0.858，0.868，0.966的这几个未知杂质的含量都得到了有效降低，使得上述含二十碳五烯酸乙酯的组合物可作为制备食品或药品的原料。