一种从头合成胆甾-5,7,24-三烯-3β醇酿酒酵母基因工程菌及其构建方法与应用

本发明属于生物，具体涉及一种合成活性维生素d3关键中间体的酿酒酵母基因工程菌株，及其构建方法和应用。

背景技术：

1、维生素d(vitamin d)是一种9,10类固醇，已鉴定出6种形式，維生素d2(9,10-seco(5z，7e)-5,7,10(19)，22-麦角酸四烯-3β-醇；麦角钙化醇)和维生素d3(9,10-seco(5z，7e)-5,7,10(19)胆甾三烯-3β-醇；胆钙化醇)是与人类营养相关的维生素d的主要形式。维生素d3具有抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。活性维生素d3是维生素d3在动物体内的活性代谢物，相对于维生素d3具有更强的活性。其除了能够调节体内钙磷代谢以外，还广泛的应用于饲料添加剂中，以促进禽类动物的骨骼发育。此外，可以提高机体免疫能力、降低心血管疾病等风险。另外也有研究显示维生素d3的补充有可能降低包括covid-19在内的许多病毒感染引起的细胞因子风暴所导致的肺炎发生率、严重程度和死亡风险(covid-19disease and vitamin d:a mini-review.frontiers inpharmacology,2020,11:604579.)。

2、胆甾-5,7,24-三烯-3β醇是活性维生素d3的一种重要中间体，在工业上可作为骨化二醇(calcifediol)合成的起始物，随后进一步合成为骨化三醇(calcitriol)。此外，该物质也是其他胆固醇类药物的合成中间体，具有很高的经济价值。建立获得胆甾-5,7,24-三烯-3β醇的生产工艺能够改变以维生素d3等高价原料作为反应底物的生产现状，有效降低生产成本。维生素d3其他中间体的制备方法在此前也有报道，例如cn107098799a(2017-08-29)中公开了一种活性维生素d3类药物cd环中间体的制备方法，二醇衍生物具体经过了羟基反应、碘取代反应、亲核加成反应、迈克尔加成反应、脱保护反应和氧化反应制得最终的活性维生素d3类药物cd环中间体。又例如cn114702542a(2022-05-11)中公开了一种活性维生素d3中间体25-羟基-7-去氢胆固醇的合成方法，以21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮为原料进行水解，磺化，利用羰基还原酶或者硼氢化钠3位羰基还原反应，乙酰化，碘取代，甲基乙烯酮加成反应，甲基格式试剂加成反应等步骤最终进行合成，但是该方法路线复杂，试剂使用量大，经济成本时间成本高，为了满足全球日益增长的维生素d3的需求，开发工艺更简单、成本更低且环境更友好的工业化合成技术是现阶段研究的主要目标。

3、然而，甾醇类化合物结构复杂、来源受限，传统的化学合成法以植物源的甾体母核提取为基础，通过多步生物转化和化学合成的方式获得。但该方式资源依赖度高、原料提取和转化过程效率低，经济性能差、三废排放量大。合成生物学在过去十年高速发展，通过高效细胞工厂的工程化设计和构建为高附加值化学品的绿色生产提供了新的思路。以安全、高效以及环境友好的以酵母为细胞工厂从头合成胆甾-5,7,24-三烯-3β醇，为工业生产胆甾-5,7,24-三烯-3β醇提供新的思路和方法。

4、胆甾-5,7,24-三烯-3β醇与酵母体内的麦角甾醇类似，可通过对酵母体内麦角甾醇路径的修饰来实现胆甾-5,7,24-三烯-3β醇在酵母体内的合成，因此，酵母是甾体类等药物生产的优良宿主。可通过敲除麦角甾醇合成途径中的erg5和erg6可以实现在酿酒酵母中生产胆甾-5,7,24-三烯-3β醇。本研究通过采用敲除相关抑制基因、加强前体供应、引导前体向目标产物的转化、提高细胞内还原力供应和扩张关键基因锚定的细胞器等策略，对于后续甾体类药物的开发具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供了一株高效合成胆甾5,7,24-三烯醇的酿酒酵母工程菌，及其构建方法和应用的技术方案。

2、本发明采用的技术方案是：

3、一种胆甾-5,7,24-三烯-3β醇高效合成的酿酒酵母基因工程菌株，由如下方法构建获得：将底盘菌酿酒酵母基因组强化表达截短3-羟基-3甲基戊二酰辅酶a还原酶thmg1、角鲨烯环氧酶erg1、c-8甾醇异构酶erg2、nadh激酶pos5、羊毛甾醇去甲基化酶erg11、羊毛甾醇合酶erg7、异戊烯基焦磷酸异构酶idi1、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf1、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶gnd1，敲除麦角固醇合成所需的c-22甾醇去饱和酶erg5、δc-24甾醇甲基转移酶erg6、麦角固醇合成基因转录阻遏因子mot3以及mg2+依赖性磷脂酸(pa)磷酸酶pah1，获得所述胆甾-5,7,24-三烯-3β醇高效合成的酿酒酵母菌株。

4、优选的，所述底盘菌为酿酒酵母cen.pk2-1c。

5、所述强化表达是指在酿酒酵母基因组上强化表达多拷贝数的thmg1(可将3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶thmg1整合至酿酒酵母基因组转座子ty1cons1位点两端的重复δ序列)，多拷贝数的erg1、pos5(可将角鲨烯环氧酶erg1、nadh激酶pos5整合至酿酒酵母基因组转座子ty1cons2位点两端的重复δ序列，以及将erg1整合至mot3位点)，多拷贝数的erg11、idi1、erg7(可将羊毛甾醇去甲基化酶erg11、羊毛甾醇合酶erg7、异戊烯基焦磷酸异构酶idi1整合至酿酒酵母基因组转座子ty3cons位点两端的重复ω序列)，以及在基因组上强化表达的1个拷贝数的zwf1、1个拷贝数的gnd1、1个拷贝数的erg2。

6、所述thmg1的gene id为42650，所述idi1的gene id为855986，所述pos5的gene id为855913，所述erg2的gene id为855242，所述erg1的gene id为853086，所述erg11的geneid为856398，所述erg7的gene id为856470，所述erg5的gene id为855029，所述erg6的geneid为855003，所述mot3的gene id为855092，所述pah1的gene id为855201。

7、具体的，本发明通过pgap启动子强化表达thmg1，通过pgap启动子强化表达erg11，通过pgal1，10双向启动子强化表达erg1和pos5，通过pgal1，10双向启动子强化表达erg7和idi1，通过pgal1，10双向启动子强化表达zwf1和gnd1，通过pgal1，10双向启动子强化表达erg1和erg2。

8、更为具体的：

9、通过pgal1,10双向启动子强化表达erg1和erg2整合至酿酒酵母基因组上的mot3位点，所述mot3的gene id为855092；

10、通过pgal1,10双向启动子强化表达zwf1和gnd1整合至酿酒酵母基因组上的pah1位点，所述pah1的gene id为855201；

11、通过pgal1,10双向启动子强化表达idi1和erg7，并同时通过pgap强化表达erg11整合至酿酒酵母基因组上的ty3cons位点两端的重复ω序列；

12、通过pgal1,10双向启动子强化表达erg1和pos5整合至酿酒酵母基因组上ty1cons2位点两端的重复δ序列；

13、通过pgap强化表达thmg1整合至酿酒酵母基因组上的ty1cons1位点两端的重复δ序列。

14、本发明还涉及构建所述酿酒酵母菌株的方法，所述方法包括如下步骤：

15、(1)敲除麦角固醇合成所需的c-22甾醇去饱和酶erg5，构建得到的酿酒酵母命名为bl1菌株；

16、(2)敲除bl1菌株基因组上麦角固醇合成所需的c-24甾醇甲基转移酶erg6，构建得到的酿酒酵母命名为bl2菌株；

17、(3)将ttef-tadh1-erg2-pgal10-pgal1-erg1-tcyc1片段整合至bl2菌株基因组上，整合至mot3位点(mot3位点的gene id为855092)，构建得到酿酒酵母命名为bl3菌株；

18、(4)将ttef-tadh1-gnd1-pgal10-pgal1-zwf1-tcyc1片段整合至bl3菌株基因组上，整合至pah1位点(pah1位点的gene id为855201)，构建得到酿酒酵母命名为bl4菌株；

19、(5)将pgap-thmg-tcyc1片段整合至bl4菌株基因组上ty1cons1两端的δ序列(引导序列为taaacatataaaacggaatg)中，构建得到酿酒酵母菌株命名为bl5菌株；

20、(6)将ttef-tadh1-erg7-pgal10-pgal1-idi1-tcyc1-pgap-erg11-tcyc1片段整合至bl5株基因组上ty3cons两端的ω序列(引导序列为agctgaactacccaaaagta)中，构建得到酿酒酵母菌株命名为bl6菌株；

21、(7)将ttef-tadh1-pos5-pgal10-pgal1-erg1-tcyc1片段整合至bl6菌株基因组上ty1cons2两端的δ序列(引导序列为gaattgcagattccctttta)中，构建得到酿酒酵母菌株命名为bl7菌株；

22、本发明还涉及所述酿酒酵母菌株在微生物发酵制备胆甾-5,7,24-三烯-3β醇中的应用。

23、具体的，所述应用为：将所述酿酒酵母菌株接种至发酵培养基，于28～32℃下进行发酵培养48～96h，发酵液经细胞破碎、皂化萃取获得所述胆甾-5,7,24-三烯-3β醇。

24、通常的，先将重组酿酒酵母接种至种子培养基，制备得到种子液，将制备得到的种子液以1～10％(v/v)的接种量再接入发酵培养基中。所述种子培养基通常为ypd培养基。本发明中，所用ypd培养基组成如下：蛋白胨20g/l，酵母粉提取物10g/l，无水葡萄糖20g/l。在本发明的一种实施方式中，所述ypd培养基每升组分包括：2％蛋白胨，1％酵母粉提取物，2％无水葡萄糖。

25、有益效果：本发明以酿酒酵母cenpk2-1c为宿主，完成竞争路径基因erg5、erg6的敲除(如图1所示)，初步实现在酿酒酵母体内胆甾-5,7,24-三烯-3β醇的合成。在此基础上，敲除了非路径基因mot3、pah1进一步提高酿酒酵母体内胆甾-5,7,24-三烯-3β醇的积累。通过增加限速步骤基因thmg1、idi、erg1、erg7、erg11基因的多拷贝整合与限速步骤erg2、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf1、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶gnd1基因的单拷贝整合，进一步提高了胆甾-5,7,24-三烯-3β醇积累量，使构建的酿酒酵母工程菌在ypd培养基中摇瓶发酵96h时胆甾-5,7,24-三烯-3β醇产量达102.20mg/l，由本发明构建的酿酒酵母基因工程菌株具有较高的产物累积，为替代传统多步化学合成路线，实现工业化生产奠定基础。