一种从头合成罗汉果甜苷的工程酵母的构建方法与流程

本发明涉及工程酵母的构建方法，尤其一种从头合成罗汉果甜苷的工程酿酒酵母的构建方法。

背景技术：

1、罗汉果甜苷(mogroside)是一类来源于罗汉果果实的葫芦烷型四环三萜类次级代谢产物，以罗汉果醇作为苷元，在c-3、c-24分别以不同的糖苷键连接不同数量的糖基，包含罗汉果甜苷i a1、罗汉果甜苷ii e、罗汉果甜苷iiix、赛门苷i、罗汉果甜苷iv a、罗汉果甜苷v等多种结构。众多罗汉果甜苷中，罗汉果甜苷v是含量以及甜度均较高的成分，也是罗汉果的主要甜味来源，其化学式为c60h102o29，相对分子质量为1287.43。罗汉果甜苷v于1995年被fda认证为安全无毒，允许其被用作食品添加剂，因其甜度高、热量低、无发酵性等特征，不会引起肥胖或者龋齿，故罗汉果甜苷v是一种理想的天然蔗糖替代品。由于此类物质普遍具有抗炎、调节人体糖代谢或脂代谢等作用，即使甜度不及罗汉果甜苷v，其他罗汉果甜苷也被广泛应用于药物或化妆品的生产。可见，罗汉果甜苷具有广阔的应用前景。

2、目前，罗汉果甜苷的工业生产主要是从罗汉果果实中进行提取的，但是，罗汉果甜苷的平均含量不足罗汉果干重的1％，因此直接提取法对于罗汉果果实的需求量大，但罗汉果的种植量有限，且易受到土壤条件以及气候条件的影响，提取效率低，不仅提高成本而且造成浪费。本世纪初，合成生物学的崛起，打破了特定物种生产对应产物的限制，使微生物合成罗汉果甜苷成为现实。微生物合成罗汉果甜苷不受自然条件制约，生产周期较短，产物能够分泌至胞外易于分离，产物污染小，适合大规模生产。

3、酵母不仅能够用于酿酒、制作面包和馒头等食品，随着基因编辑技术的发展，也能够以酿酒酵母为底盘细胞实现天然产物的生产。酵母具有低致病性，高抗逆性，受噬菌体污染的概率较低等优点，故其在基因工程领域发挥着重要作用。然而，酵母中没有罗汉果甜苷合成的代谢通路，目前，未有关于微生物发酵法以葡萄糖为底物从头合成罗汉果甜苷的相关报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种从头合成罗汉果甜苷工程酵母的构建方法。该方法是将外源基因整合至酵母基因组并通过代谢工程的手段对酵母进行调控、改造，使得酵母实现罗汉果甜苷的高效以葡萄糖为底物发酵从头合成。

2、具体地，一种从头合成罗汉果甜苷工程酵母的构建方法，将构建的葫芦二烯醇合成酶基因表达框ptef1-cds-tcyc1、环氧水解酶基因表达框ptef1-eph3-tcyc1、细胞色素p450酶编码基因cyp与细胞色素p450酶还原酶基因表达框ttdh3-cyp87d18-pgal1/10-atcpr2-tcyc1和糖基转移酶编码基因表达框tadh1-ugt74ac1-pgal1/10-ugtms1-tcyc1，插入酵母基因组中，获得罗汉果甜苷生产工程酵母(以下简称为：重组工程酵母)。

3、进一步地，构建截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因表达框ptef1-thmg1-thmg1，并插入重组工程酵母基因组中的gal80位点，解除mva途径的限速步骤，同时不受半乳糖的诱导，罗汉果甜苷的合成途径开启只受到葡萄糖浓度的调控。

4、进一步地，替换重组工程酵母中的羟甲基戊二酰辅酶a合酶基因erg13以及角鲨烯合成酶erg9的内源启动子为强启动子ptef1，强化了罗汉果甜苷前体物质的累积。

5、进一步地，增加重组工程酵母的角鲨烯环氧化酶基因erg1的拷贝数，促使中间体角鲨烯更多地流向目标产物罗汉果甜苷。

6、进一步地，敲除重组工程酵母的旁路羊毛甾醇途经的关键酶羊毛甾醇合成酶基因erg7，避免旁路途径罗汉果甜苷的前体物质的竞争。

7、进一步地，为实现cyp87d18的多拷贝表达，向重组工程酵母中转化多拷贝质粒pesc-g418-ttdh3-cyp87d18-pgal1/10-atcpr2-tcyc1，获得优化的工程酵母。

8、本发明，所述工程酵母包括但不限于酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、发酵毕赤酵母、异常汉逊酵母、解脂耶氏酵母、南极假丝酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、粟酒裂殖酵母、黏红酵母。

9、一个实施例中，所述工程酵母为酿酒酵母，葫芦二烯醇合成酶基因ptef1-cds-tcyc1的表达框插入酵母基因组1622b位点；环氧水解酶基因表达框ptef1-eph3-tcyc1插入酵母基因组911b位点；细胞色素p450酶编码基因cyp与细胞色素p450酶还原酶基因表达框ttdh3-cyp87d18-pgal1/10-atcpr2-tcyc1插入酵母基因组的106a位点；糖基转移酶编码基因表达框tadh1-ugt74ac1-pgal1/10-ugtms1-tcyc1插入酵母基因组的308a位点；截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因表达框ptef1-thmg1-thmg1插入酵母基因组的gal80位点。

10、本发明还提供了从头合成罗汉果甜苷工程酵母。

11、具体地，从头合成罗汉果甜苷工程酵母，酵母基因组中含有葫芦二烯醇合成酶基因表达框ptef1-cds-tcyc1、环氧水解酶基因表达框ptef1-eph3-tcyc1、细胞色素p450酶编码基因cyp与细胞色素p450酶还原酶基因表达框ttdh3-cyp87d18-pgal1/10-atcpr2-tcyc1和糖基转移酶编码基因表达框tadh1-ugt74ac1-pgal1/10-ugtms1-tcyc1。

12、所述酵母基因组中含有截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因表达框ptef1-thmg1-thmg1。

13、所述酵母中的羟甲基戊二酰辅酶a合酶基因erg13以及角鲨烯合成酶erg9的内源启动子为强启动子ptef1。

14、所述酵母中的角鲨烯环氧化酶基因(erg1)的拷贝数为3个以上。

15、所述酵母中，敲除了旁路羊毛甾醇途经的关键酶羊毛甾醇合成酶基因erg7。

16、所述酿酒酵母中还包含多拷贝质粒pesc-g418-ttdh3-cyp87d18-pgal1/10-atcpr2-tcyc1。

17、进一步地，所述酵母为酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、发酵毕赤酵母、异常汉逊酵母、解脂耶氏酵母、南极假丝酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、粟酒裂殖酵母、黏红酵母。

18、一个实施例中，所述工程酵母为酿酒酵母，其基因组中，1622b位点插入所述葫芦二烯醇合成酶基因表达框ptef1-cds-tcyc1；911b位点插入所述环氧水解酶基因表达框ptef1-eph3-tcyc1；106a位点插入所述细胞色素p450酶编码基因cyp与细胞色素p450酶还原酶基因表达框ttdh3-cyp87d18-pgal1/10-atcpr2-tcyc1；308a位点插入所述糖基转移酶编码基因表达框tadh1-ugt74ac1-pgal1/10-ugtms1-tcyc1；gal80位点插入所述截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶基因表达框ptef1-thmg1-thmg1。

19、本发明还提供了从头合成罗汉果甜苷工程酵母的应用，具体涉及其在生物发酵生产罗汉果甜苷中的应用。

20、本发明中，所述工程酵母发酵生产罗汉果甜苷的方法为：取所述工程酵母菌株于液态ypd培养基，30℃，220r/min条件下摇床培养18h，得发酵种子液；将所述发酵种子液以3％的接种率转入发酵培养基，于30℃，220r/min条件下培养96h。

21、本发明的有益效果：

22、1.本发明提供的酿酒酵母可以实现以葡萄糖为底物发酵生产罗汉果甜苷，产物可分泌至胞外，为下游的分离纯化步骤奠定了良好的基础。酿酒酵母具有内源的mva途径，能够合成罗汉果甜苷的重要前体物质角鲨烯，随后角鲨烯依次在外源角鲨烯环氧化酶、葫芦二烯醇合成酶、环氧水解酶、细胞色素p450酶(及其伴生蛋白细胞色素p450还原酶)、糖基转移酶的催化作用下合成罗汉果甜苷。

23、本发明提供的最终的酿酒酵母菌株mogrol 09的罗汉果甜苷v的产量达5.6mg/l，是初步能够合成罗汉果甜苷v的酿酒酵母菌株mogrol 04的467倍。最终的菌株mogrol 09的罗汉果甜苷iie、罗汉果甜苷iiix、罗汉果甜苷iva、赛门苷等其他罗汉果甜苷产量同样显著高于初步能够合成罗汉果甜苷v的菌株mogrol 04。

24、2.本发明提供的酵母构建方法简单，便于使用，具有良好的前景。

25、本发明采用crispr cas9的基因编辑技术将合成通路关键酶葫芦二烯醇合成酶cds、环氧水解酶eph、细胞色素p450酶、细胞色素p450酶还原酶、糖基转移酶ugt74ac1、ugtms1即罗汉果甜苷的合成代谢途径整合至酵母，使得酵母实现罗汉果甜苷的以葡萄糖为底物发酵从头合成。

26、4.本发明提供的酵母以启动子ptef1、pgal1/10控制罗汉果甜苷合成通路基因的表达，整合截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶thmg1，并增加角鲨烯环氧化酶基因erg1的拷贝数，敲除旁路羊毛甾醇途经的关键酶羊毛甾醇合成酶基因erg7，避免旁路途径罗汉果甜苷的前体物质的竞争并转化多拷贝质粒pesc-g418-ttdh3-cyp87d18-pgal1/10-atcpr2-tcyc1，实现cyp87d18的多拷贝表达，使得酵母能够高效地以葡萄糖为底物发酵从头合成罗汉果甜苷。