一种提高罗非鱼分离蛋白溶解度的方法

本发明属于蛋白改性加工，具体涉及一种提高罗非鱼分离蛋白溶解度的方法。

背景技术：

1、日本排放核污水事件使海洋食品加工领域面临严峻的挑战，同时使得大宗淡水鱼类资源的开发与利用受到越来越多的关注。罗非鱼是一种具有环境适应能力强、生长速度快、低脂肪，高蛋白等优势的淡水鱼，在我国水产品加工与出口行业中占据重要地位。当前，罗非鱼加工制品主要以冷冻罗非鱼、鱼片、鱼糜凝胶制品为主，精深加工产品高度不足。采用碱溶-酸沉工艺可有效提取罗罗非鱼分离蛋白，提高罗非鱼蛋白的利用效率。罗非鱼分离蛋白具有高营养、易获取、可持续的优势，是潜在的优质动物蛋白替代品。但是，罗非鱼分离蛋白固有的低溶解度限制了罗非鱼分离蛋白在食品工业中的应用。因此，如何提高罗非鱼分离蛋白的水溶性，是罗非鱼精深加工产业发展所面临的关键科学问题。

2、近几年兴起的双蛋白工程为上述问题的解决提供了可能的途径。通过亲水蛋白与疏水蛋白的重组可以有效提高难溶蛋白的水溶性。采用ph循环诱导法可制备乳清蛋白纳米纤维稳定的玉米醇溶蛋白纳米颗粒，该颗粒表现出良好的水分散性及抗氧化活性，同时可作为疏水生物活性分子的递送载体以提高玉米醇溶蛋白的应用价值。亲水性的大豆分离蛋白在ph循环诱导下与小麦醇溶蛋白互作可制备亲水性的共组装结构，从而极大地提高小麦醇溶蛋白的溶解度。在最新的研究中，对经过ph循环制备的大豆和小麦共沉淀蛋白进行表征，发现其溶解性相较于两种单独的蛋白得到了显著提升。然而，蛋白共组装目前仅应用于难溶植物蛋白水溶性的改善，还没有关于水产蛋白溶解度提高的研究。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明利用ph循环诱导方法促使罗非鱼分离蛋白与酪蛋白酸钠通过超分子共组装形成亲水性的共组装体结构，从而提出一种提高罗非鱼分离蛋白溶解度的方法。

2、本发明的技术方案为：

3、本发明提供一种提高罗非鱼分离蛋白溶解度的方法，包括采用ph循环诱导方法，使得罗非鱼分离蛋白与酪蛋白酸钠形成亲水性的共组装体结构，得到溶解度显著提高的罗非鱼分离蛋白。具体包括以下步骤:

4、s1.罗非鱼分离蛋白提取；

5、取一定质量的罗非鱼肉在4℃的条件下解冻，将鱼肉搅碎后加入冰蒸馏水，使用高速分散机均质，将溶液ph调节碱性并搅拌，随后使用离心处理。上清液使用棉纱布过滤后调节ph至酸性，然后再次离心。取沉淀加少量冰水分散，并将分散液的ph值调整为7，使用透析袋透析。将透析后的蛋白溶液通过冷冻干燥机冻干成粉体。

6、s2.罗非鱼分离蛋白-酪蛋白酸钠共组装体的制备；

7、将罗非鱼分离蛋白分散于去离子水，调节分散液的ph至碱性，并搅拌使罗非鱼分离蛋白充分溶解。分别加入不同质量的酪蛋白酸钠，在碱性条件下搅拌以获得不同罗非鱼分离蛋白与酪蛋白酸钠质量比例的混合液，将ph调节至中性附近，并继续搅拌以制备共组装体溶液。将制备的共组装体溶液使用透析袋透析除去溶液中的氯化钠。新鲜制备的共组装体直接用于分析或者使用冷冻干燥机冻干成粉体。

8、本发明对罗非鱼分离蛋白溶溶解度的影响，主要在于蛋白亚基重组为亲水共组装体导致罗非鱼分离蛋白的粒径、表面疏水性显著性降低，分子聚集效应明显弱化。最终，导致罗非鱼分离蛋白的溶解度显著提高。

9、本发明中，在强碱性环境的诱导下，罗非鱼分离蛋白和酪蛋白酸钠的蛋白亚基高度解离，导致蛋白溶解度显著提升。将ph调回中性的过程中，酪蛋白酸钠的亚基与罗非鱼分离蛋白的亚基通过氢键和疏水相互作用结合，形成亲水的共组装体结构，亲水的亚基分布于共组装体的表面，疏水性的亚基包埋于共组装体的内部，从而形成共组装体。

10、进一步的，所述步骤s1中，所述罗非鱼分离蛋白的制备具体包括以下步骤：

11、s11：取一定质量的罗非鱼肉在4℃的条件下解冻，将鱼肉搅碎后加入冰蒸馏水，鱼肉与水的比例为1:6~1:20（w/w）；使用高速分散机均质后将溶液的ph调至10~12并搅拌处理，随后使用离心机离心除去沉淀；

12、s12：上清液使用棉纱布过滤后调节ph为5~6，然后继续离心；将获得的沉淀加少量冰水分散，调整ph值为7，并使用8000~14000da的透析袋进行透析48h；将透析后的蛋白溶液使用冷冻干燥机冻干成粉体。

13、进一步的，所述步骤s2中，罗非鱼分离蛋白分散于水中的浓度为0.5~2%（w/v），并在ph10~12条件下搅拌溶解；添加酪蛋白酸钠，调整罗非鱼分离蛋白与酪蛋白酸钠的质量比为2:1~1:2，并在ph10~12条件下搅拌1~2h，期间注意加入碱液维持ph恒定；然后，将混合蛋白溶液的ph调节至6.5~7.5，并继续搅拌10~30min；将制备的共组装体溶液使用8000~14000da的透析袋进行透析24h；使用冷冻干燥机冻干成粉体。本发明中，共组装体制备过程中混合蛋白的初始碱性ph越高，蛋白亚基解离越快速、彻底，ph范围设置在10~12可获得最佳效果。

14、本发明中，罗非鱼分离蛋白与酪蛋白酸钠的质量比是影响共组装体形成、稳定性以及溶解度的关键因素。当罗非鱼分离蛋白与酪蛋白酸钠的质量比为1:1时，对罗非鱼分离蛋白具有最好的增溶效果。当两者质量比大于1:1时，酪蛋白酸钠的分量不足，由于粒径大，表面疏水性高，分子聚集严重等原因，导致形成的共组装体不稳定，进而罗非鱼分离蛋白的溶解度较低。当罗非鱼分离蛋白与酪蛋白酸钠的质量比小于1:1时，酪蛋白酸钠的分量充足，由于粒径先减小后增大，表面疏水性降低，分子聚集较轻，使得形成的共组装体稳定。但是，由于引入过多的酪蛋白酸钠，将会弱化对罗非鱼分离蛋白的增溶效果，计算得到的罗非鱼分离蛋白的溶解度将会降低。

15、本发明方法还提供一种制备方法在提高水溶性蛋白中的应用，所述水溶性蛋白包括乳清蛋白、大豆蛋白、蛋清蛋白、牛血清白蛋白任一项。

16、本发明与现有技术相比，本发明可获得以下有益效果：

17、利用ph循环诱导方法制备罗非鱼分离蛋白-酪蛋白酸钠共组装体，显著性降低罗非鱼分离蛋白的粒径，表面疏水性及分子聚集度，极大提高了罗非鱼分离蛋白的溶解度（最大值为77.08%）。

18、本发明提出的采用ph循环诱导制备共组装体的技术方案使罗非鱼分离蛋白的溶解度提升至77.08%，比采用碱溶-酸沉法提取的罗非鱼分离蛋白的溶解度（7.18%）提高了9.74倍，较现有通过与大豆蛋白制备共沉淀蛋白的方法（罗非鱼蛋白与大豆蛋白质量比为1:1,ph 7时，共沉淀蛋白总溶解度为74%，计算罗非鱼分离蛋白的溶解度为37%）提高了1.08倍；

19、其中，大豆蛋白制备共沉淀蛋白的方法，采用期刊 molecules发表的correlationbetween the water solubility and secondary structure of tilapia-soybeanprotein co-precipitates一文中使用的方法；

20、（3）相比于其它的方法，ph循环诱导方法制备罗非鱼分离蛋白-酪蛋白酸钠共组装体具有操作简单、绿色、低能耗、高效率等优势，是提高罗非鱼分离蛋白溶解度的高效方法之一。