一种用于宫颈癌多病理类型的类器官组合式培养基及应用的制作方法

本发明涉及宫颈癌类器官培养，具体涉及一种用于宫颈癌多病理类型的类器官组合式培养基及应用。

背景技术：

1、宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤，2020年全世界约有60.4万新病例，34.2万死亡病例；在我国目前每年有约11万例新发女性患者，5.9万死亡病例，较2018年3.4万例死亡病例，数据有所上升，广大妇女的健康和生命受到了严重威胁。随着hpv疫苗及宫颈癌三阶梯筛查在全球范围逐渐被推广，宫颈癌死亡率有所下降。但在许多发展中国家，宫颈癌仍是女性死亡的重要病因。宫颈癌的组织病理类型为鳞癌、腺癌、腺鳞癌及罕见难治类型宫颈癌(如宫颈小细胞癌、宫颈透明细胞癌等)。除宫颈鳞状上皮细胞癌以外的其他病理类型宫颈癌罕见但恶性程度极高，且目前研究较少。除了手术、放疗和化疗等传统治疗方式，宫颈癌新型靶向药物治疗相关的基础研究和临床试验也正如火如荼地展开。因此，为进一步提高、改善宫颈癌靶向药物治疗效果，我们迫切需要更为深刻地认识宫颈癌的生物学特性以及纷繁复杂的肿瘤微环境，在体外构建贴近真实世界的宫颈肿瘤微环境模型是进一步理解宫颈癌的发生发展机制，进行精准治疗探索的必备条件。

2、既往宫颈癌相关基础研究主要依赖于传统2d细胞系、传统2d细胞系构建相应的荷瘤小鼠、以及人源性移植(patient-derived tumor xenograft,pdx)动物模型，例如人源永生化细胞系hela、siha、caski以及鼠源细胞系tc-1等等，细胞系建立时间较长，应用广泛，其优点是肿瘤细胞系类型丰富，培养成本较低，适用范围广泛，然而临床预测能力较差：①持续传代造成突变累积、基因图谱迥异于原发样本；②缺乏细胞异质性、组织特异性结构；③缺乏细胞间相互作用和细胞外基质。pdx模型可较好的拟合原肿瘤的生物学特性，保留一定的患者异质性，然而也存在明显不足：①患者源性宫颈癌裸鼠成瘤周期为2～6个月，pdx培养周期较长；②实验操作复杂；③动物长期饲养费用较高，环境要求高；④不可控因素较多；⑤pdx构建对移植肿瘤细胞数量有较高要求；⑥所得移植瘤混入鼠来源成分，物种间差异可能对实验结果造成影响。因此，建立人源化的高保真hpv感染宫颈病变模型迫在眉睫。

3、类器官则能很好的弥补以上模型的不足，类器官技术是暨二维细胞培养及动物模型以外的第三种人类疾病核心研究模型，通过在体外三维环境中培养干细胞再现来源组织的结构和分子特征，具有建模时间短、建模成功率高、保真性好等优势。这些3d系统可复制出已分化组织的复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞、以及细胞与基质之间的相互作用。理想状态下，类器官与体内分化的组织具有相似的生理反应和功能特点。2017年，类器官荣膺nature methods年度生命科学技术。2019年，被《the new england journal ofmedicine》杂志评为优良的临床前疾病模型。培养成功的类器官可广泛用于疾病模型构建、基础研究、肿瘤个体化治疗等领域。此外，相比于细胞系和pdx，肿瘤类器官还兼具费用适中的特点，同时可避免动物成瘤，更符合动物伦理和缩短实验时间。肿瘤类器官高度保持了来源肿瘤的遗传及形态学异质性，具有可操作性强、经济性和高效性的特点，因此可以充当基础研究与临床应用之间的桥梁，补充甚至可能替代基于细胞系和pdx的相关研究。由于类器官是“个体化模型”，每位肿瘤患者均可建立自己的肿瘤类器官，再配合各自独特的微环境细胞，有望成为保真性最强、最贴近临床实际情况的体外研究模型，在研究肿瘤发生、进展、耐药机制研究、新药筛选、个性化治疗等方面具有突出价值。目前已有肠道、肝脏、肾脏、大脑等多种类器官培养的报道，在妇科恶性肿瘤方面，卵巢、子宫内膜肿瘤方面均有类器官生成的报道，而宫颈癌类器官的培养则较为缺少，尤其目前的报道仅针对宫颈鳞状上皮细胞癌，针对性差，培养其他病理类型宫颈肿瘤时往往导致类器官扩增速度慢，甚至难以传代，同时会带来正常类器官比例过高的风险和成本增高的弊端。鉴于此，本发明提供一种用于宫颈癌多病理类型的类器官组合式培养基及应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种用于宫颈癌多病理类型的类器官组合式培养基及应用。目的是通过对肿瘤生长相关信号通路的刺激优化培养成分，同时开发通用的适用于宫颈癌多病理类型的类器官组合培养基，实现降本增效。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、第一方面是提供一种用于宫颈癌多病理类型的类器官组合式培养基，所述类器官组合式培养基包括培养基a液、培养基b液、培养基c液和培养基d液中的任一种或至少两种的组合；

4、所述培养基a液包括以下组分：溶剂advanced dmem/f12培养液、hepes培养液添加物、青霉素-链霉素-两性霉素b混合溶液、glutamax培养液添加物、支原体去除试剂、recombinant human noggin、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,fgf)7、sb202190、nicotinamide、n-acetylcysteine、forsklin、b-27培养液无血清添加物、y-27632、a83-01。其中成分recombinant human noggin是骨形态发生蛋白抑制剂的分泌蛋白，其以不同的亲和力与骨形态发生蛋白4、骨形态发生蛋白7等结合；骨形态发生蛋白作为转化生长因子β超家族的一种分泌信号因子，可以抑制wnt信号，以此控制干细胞的自我更新。有研究证实，大鼠肝类器官的长期培养需要维持高水平的wnt信号传导以及对骨形态发生蛋白信号的持续抑制，在wnt或noggin缺失条件下，干细胞标记物lgr5的表达也有所下降，这表明lgr5的表达可能也依赖于wnt激活和骨形态发生蛋白的抑制。因此，recombinanthuman noggin在类器官的长期培养中可能通过对lgr5表达和wnt信号传导产生影响从而发挥作用，以此促进干细胞的扩增。成分fgf-7作为成纤维细胞生长因子的一员，广泛分布于体内多种组织器官，是一种对细胞生长、增殖以及分化具有调控作用的生长因子。成纤维细胞生长因子通过抑制骨形态发生蛋白信号以及提高wnt信号传导从而在类器官培养中发挥作用，是体外类器官培养中较常见的细胞因子之一。在类器官培养中最常见的家族成员为成纤维细胞生长因子2、成纤维细胞生长因子7以及成纤维细胞生长因子10。

5、所述培养基b液包括以下组分：溶剂advanced dmem/f12培养液、表皮生长因子(epidermal growth factor)、fgf-10、wnt信号通路激动剂chir 99021。其中成分表皮细胞生长因子是人体内一种重要的细胞因子，其功能主要是促进皮肤细胞的分裂，同时表皮细胞生长因子也可以促进细胞的增殖；在某些部位的类器官培养中，表皮细胞生长因子可以促进细胞增殖和分化。成分wnt信号通路激动剂chir99021是糖原合酶激酶3的抑制剂，在多种信号通路途径如wnt/β-catenin、nodal和mapk等通路中发挥调控作用；wnt信号通路激动剂chir99021可以作为wnt/β-catenin信号通路的激活剂，通过抑制糖原合酶激酶3通路以及β-catenin的降解，促进β-catenin在细胞核内的积累和axin2表达，以此激活wnt信号通路的经典途径；同时，wnt信号通路激动剂chir99021达到一定浓度时可以激活wnt信号通路，与r-spondin-1起到类似作用。chir99021和recombinant human noggin联合使用可以增强lgr5阳性细胞的自我更新和增殖能力，使得类器官形成效率有所提高。

6、所述培养基c液包括以下组分：溶剂advanced dmem/f12培养液、表皮生长因子(epidermal growth factor)、重组人rspo1蛋白、wnt信号通路激动剂chir 99021。其中，成分重组人rspo1蛋白作为wnt信号通路的激动剂，可以通过β-catenin/tcf途径来激活wnt信号通路；也有文献提出，r-spondin-1与lgr5结合后，抑制rnf43/znrf3介导的wnt受体降解，以此维持wnt信号通路的持续激活；r-spondin-1/lgr5信号通路可以正向促进wnt信号通路，以此促进干细胞增殖和分裂，并有助于维持干细胞的表征。

7、所述培养基d液包括以下组分：溶剂advanced dmem/f12培养液、表皮生长因子(epidermal growth factor)、重组人rspo1蛋白、重组人jagged-1、wnt信号通路激动剂chir 99021。其中组分重组人jagged-1是多种notch受体的配体，参与notch信号的介导，在体外增强成纤维细胞生长因子诱导的血管生成。

8、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

9、进一步，所述类器官组合式培养基包括培养基a液，或所述培养基a液与所述培养基b液、所述培养基c液、所述培养基d液中的至少一种的组合；

10、进一步，所述培养基a液中各组分浓度如下：5～15mm hepes培养液添加物、1～10x青霉素-链霉素-两性霉素b混合溶液、1～10mm glutamax培养液添加物、1～5x支原体去除试剂、100～1000ng/ml recombinant human noggin、20～200ng/ml成纤维细胞生长因子7、1～10um sb202190、2.5mm nicotinamide、1.25mm n-acetylcysteine、1～10um forsklin、1～5x b-27培养液无血清添加物、1～10um y-27632、50～500nm a83-01，和溶剂advanceddmem/f12培养液。

11、其中，1～10x，或是1～5x中的x的含义是稀释倍数。

12、进一步，所述培养基b液中各组分浓度如下：50～500ng/ml表皮生长因子、200～2000ng/ml fgf-10、0.1～2um wnt信号通路激动剂chir 99021，和溶剂advanced dmem/f12培养液。

13、进一步，所述培养基c液中各组分浓度如下：50～500ng/ml表皮生长因子、250～2500ng/ml重组人rspo1蛋白、0.1～2um wnt信号通路激动剂chir 99021，和溶剂advanceddmem/f12培养液。

14、进一步，所述培养基d液中各组分浓度如下：50～500ng/ml表皮生长因子，250～2500ng/m重组人rspo1蛋白；3～30um重组人jagged-1，0.1～3um chir 99021，和溶剂advanced dmem/f12培养液。

15、第二方面是提供一种用于宫颈癌多病理类型的类器官组合式培养基的应用，将所述一种用于宫颈癌多病理类型的类器官组合式培养基用于多病理类型的宫颈癌的类器官培养扩增中。

16、进一步，所述宫颈癌包括宫颈鳞状上皮细胞癌、宫颈腺癌、宫颈透明细胞癌、和/或宫颈小细胞癌。所述类器官组合式培养基针对不同的肿瘤组织，在培养基a液、培养基b液、培养基c液、培养基d液中选择其中一种或多种组合而成。

17、进一步，针对所述宫颈鳞状上皮细胞癌的类器官的培养扩增，所述类器官组合式培养基主要由培养基a液组成；

18、针对所述宫颈腺癌的类器官的培养扩增，所述类器官组合式培养基主要由培养基a液、培养基c液混合组成；其中培养基a液、培养基c液体积比为2～5:1，优先的为4:1。

19、针对所述宫颈透明细胞癌类器官的培养扩增，所述类器官组合式培养基主要由培养基a液、培养基b液混合组成；其中培养基a液、培养基b液体积比为2～5:1，优先的为4:1。

20、针对所述宫颈小细胞癌的培养扩增，所述类器官组合式培养基主要由培养基a液、培养基d液混合组成。其中培养基a液、培养基d液体积比为2～5:1，优先的为4:1。

21、第三方面是提供一种宫颈癌多病理类型的类器官的培养方法，在孔板上进行宫颈癌多病理类型的类器官的培养，所述孔板中每孔中加入400-600μl所述类器官组合式培养基，将所述孔板放入细胞培养箱培中，在37℃，体积分数为5％co2下进行培养，每间隔3～4天更换一次所述类器官组合式培养基。

22、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

23、(1)相较于传统肿瘤类器官培养基，本发明的培养基能有效激活肿瘤细胞增殖相关通路，抑制凋亡通路，更适配肿瘤类器官的生长；适配目前发病率靠前的宫颈癌种，匹配临床需求；可覆盖临床发病率较高，有临床个体化服务需求的肿瘤类型；短时间内应对宫颈多病理类型癌种时更灵活、简便、高效。

24、(2)本发明的培养基，可以有效的维持组织细胞特异性、干细胞特性，组织形态高度相似；对于具有腺体生长特点的肿瘤，通过添加生理浓度激素显著提高对应类器官扩增效率；

25、(3)本发明的组合式的培养基可以避免培养基过期导致的浪费，培养基配制成分成低，且有效期较长。