一种促进Aβ清除的化合物及其制备方法和应用

本发明涉及生物制药，更具体地，涉及一种促进aβ清除的化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、阿尔茨海默症(ad)是一种慢性中枢神经退行性疾病，以进行性认知障碍与行为损害为临床表现。以神经元外淀粉样斑块沉积及神经元内神经纤维缠结为病理特征。目前研究认为β-淀粉样蛋白(β-amyloid，aβ)是阿尔茨海默症的致病因子，aβ可导致神经元突触功能障碍，tau蛋白过度磷酸化以及神经元的炎症反应，导致神经元死亡，最终导致痴呆。

2、由于aβ的结构特性，其在生理条件下极易由单体状态聚集形成寡聚体，进而形成纤维，最终形成斑块沉积。aβ不仅可导致阿尔茨海默症，还可诱发青光眼以及视神经老年性黄斑病变等疾病。目前针对aβ的药物主要包括aβ-breaker小分子以及抗体药物，其中仅有aducanumab(aduhelm)以及lecanemab(leqembi)两款抗体上市。

3、现有技术一种抗β淀粉样蛋白活性的化合物的制备方法和应用，公开了一种化合物、或其药学上可接受的盐，还提供了该化合物的制备方法。该化合物能够显著抑制aβ诱导的细胞毒性，可用于制备β-淀粉样蛋白抑制剂、预防或治疗阿尔茨海默氏病的药物。

4、现有技术公开了基于β-淀粉样蛋白修饰的抗原多肽及其应用。该抗原多肽包括：β-淀粉样蛋白单体氨基酸片段或若干氨基酸片段组合、能够与β-淀粉样蛋白单体或寡聚体结合的小分子化合物、偶联载体蛋白。该抗原多肽可防止β-淀粉样蛋白单体聚集和清除β-淀粉样蛋白聚集体，预防和减缓ad的β-淀粉样蛋白病理异常。

5、由于aβ的易聚集特性导致的aβ自身形态的多样性，使得各种靶向aβ的小分子或者抗体难以同时靶向清除掉各种形态的aβ聚集体；同时疾病状态下，脑内的巨噬细胞吞噬清除aβ的能力下降，因此构建可激活小胶质细胞，同时清除aβ各种聚集体的分子具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明为克服靶向aβ的小分子或者抗体难以同时靶向清除各种形态的aβ聚集体、疾病状态下，脑内的巨噬细胞吞噬清除aβ的能力下降，导致aβ难以清除的问题，提供一种促进aβ清除的化合物及其制备方法和应用。

2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

3、一种促进aβ清除的化合物，其结构式为：

4、

5、其中，r选自：

6、

7、

8、进一步地，所述促进aβ清除的化合物，其结构式为：

9、

10、一种所述促进aβ清除的化合物在药物学上可接受的盐。

11、一种药物组合物，包括所述促进aβ清除化合物和/或所述促进aβ清除化合物在药物学上可接受的盐。

12、一种所述促进aβ清除化合物的制备方法，包括以下步骤：

13、s1：在树脂中加入n-芴甲氧羰基-2-萘基-l-丙氨酸(fmoc-2-萘基-l-丙氨酸)、n,n-二异丙基乙胺(diea)，反应1～3h；

14、s2：以甲醇、n,n-二异丙基乙胺(diea)和二氯甲烷封闭树脂未反应完全的位点，反应30～60min；

15、s3：用哌啶、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(dbu)和n,n-二甲基甲酰胺(dmf)脱除fmoc保护基，以5％茚三酮检测脱除完成度；

16、s4：加入溶解于n,n-二甲基甲酰胺(dmf)的fmoc保护的氨基酸原料(fmoc-aa-oh)以及缩合剂，反应30～60min，以5％茚三酮检测缩合完成度；

17、s5：重复s3，s4步骤，直至所有fmoc保护的氨基酸原料(fmoc-aa-oh)缩合完成；

18、s6：采用切割液将化合物从树脂上切除，反应1～3h，得到促进aβ清除的化合物；

19、s1～s6在温度35～48℃下进行。

20、优选地，s1～s6在温度37～45℃下进行。

21、进一步地，在s3中，以5％茚三酮乙醇溶液检测脱除完成度，当树脂显蓝色时，则提示脱除成功；在s4中，以5％茚三酮乙醇溶液检测缩合完成度，当树脂显无色时，则提示缩合完毕。

22、进一步地，所述s1中，每克树脂加入fmoc-2-萘基-l-丙氨酸1～5mmol，加入fmoc-2-萘基-l-丙氨酸与n,n-二异丙基乙胺的物质的量比为3：(3～10)。

23、优选地，所述树脂为二氯三苯基树脂。

24、优选地，所述树脂以二氯甲烷溶胀。

25、优选地，fmoc-2-萘基-l-丙氨酸与diea溶于二氯甲烷投料，在n2环境下反应。

26、进一步地，s2所述甲醇、n,n-二异丙基乙胺和二氯甲烷的体积比为3：1：16，每克s1所述树脂加入甲醇、n,n-二异丙基乙胺和二氯甲烷的总体积为5～20ml。

27、进一步地，s3所述哌啶、dbu和dmf的体积比为5：1：94，每克s1所述树脂加入哌啶、dbu和dmf的总体积为5～20ml。

28、进一步地，s4所述缩合剂由hatu、hoat和diea混合而成；所述fmoc-aa-oh、hatu、hoat和diea的物质的量比为3：3：3：6；每克s1所述树脂加入fmoc-aa-oh 1～5mmol。

29、优选地，5％茚三酮为含5％茚三酮的无水乙醇溶液。

30、进一步地，在s5中，每次重复s4时，按顺序依次添加一种所述fmoc-aa-oh；

31、fmoc-aa-oh的添加顺序为n-(9-芴甲氧羰基)-l-苯丙氨酸(fmoc-phe-oh)，n-(9-芴甲氧羰基)-l-苯丙氨酸(fmoc-phe-oh)，n-(9-芴甲氧羰基)-l-缬氨酸(fmoc-val-oh)，n-芴甲氧羰基-l-亮氨酸(fmoc-leu-oh)，nα-芴甲氧羰基-nε-叔丁氧羰基-l-赖氨酸(fmoc-lys(boc)-oh)，芴甲氧羰酰基-氨基己酸(fmoc-ahx-oh)，nα-芴甲氧羰基-nε-叔丁氧羰基-l-赖氨酸(fmoc-lys(boc)-oh)，nα-芴甲氧羰基-nε-叔丁氧羰基-l-赖氨酸(fmoc-lys(boc)-oh)，nα-芴甲氧羰基-nε-叔丁氧羰基-l-赖氨酸(fmoc-lys(boc)-oh)，nα-芴甲氧羰基-nε-叔丁氧羰基-l-赖氨酸(fmoc-lys(boc)-oh)，n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-o-叔丁基-l-丝氨酸(fmoc-ser(tbu)-oh)，n-(((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)-s-(2,3-双(棕榈酰氧基)丙基)-l-半胱氨酸(fmoc-cys(pam2)-oh)，和/或罗丹明b(rhodamine b)。

32、优选地，fmoc-cys(pam2)-oh用于制备p2cskn和fmoc-p2cskn，rhodamine b用于制备rhob-p2cskn。

33、其中，罗丹明b为荧光基团，可用于荧光示踪。

34、进一步地，在s5的s3、s4重复中，制备p2cskn和rhob-p2cskn时的重复终点为s3，制备fmoc-p2cskn时的重复终点为s4。

35、进一步地，当制备rhob-p2cskn时，s5中fmoc-aa-oh的添加顺序中包括rhodamineb；当制备p2cskn和fmoc-p2cskn时，s5中fmoc-aa-oh的添加顺序中不包括rhodamine b。

36、进一步地，s6所述切割液由三氟乙酸、苯酚、三异丙基硅烷和水以88：5：5：2的体积比混合而成；每克s1所述树脂加入切割液的体积为5～20ml。

37、优选地，s6步骤后，以冻乙醚沉淀析出粗品，通过高效液相色谱进行分离纯化促进aβ清除的化合物。

38、一种所述促进aβ清除化合物或所述促进aβ清除的化合物在药物学上可接受的盐的应用，用于制备诊断或治疗与β-淀粉样蛋白相关疾病的药物。

39、进一步地，所述与β-淀粉样蛋白相关疾病包括青光眼、老年性眼底黄斑变性和阿尔兹海默症。

40、本发明创新地合成促进aβ清除的化合物，其化学结构包括识别结合aβ的结和巨噬细胞受体激动剂的结构识别结合aβ的结构中，klvff结构片段使得化合物可与aβ结合，klvff结构片段与萘丙氨酸连接，促进了aβ的共聚集。化合物结合aβ聚集体后的化合物对aβ聚集体的形态进行调控重组，将β-sheet结构变为非β-sheet结构。巨噬细胞受体激动剂的结构可以激活tlr2受体，进而激活细胞吞噬aβ。本发明化合物促进了吞噬细胞先吞噬aβ再降解清除aβ。

41、与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：

42、(1)本发明化合物可与aβ结合并促进与aβ的共聚集。在丁达尔效应评价中，化合物与aβ混合液产生了明显的光路，表明化合物与aβ结合能力强，即产生的共聚集效应明显。激光共聚焦显微成像结构也表明，绿色荧光标记的aβ与红色荧光标记的p2cskn结合交织共聚集形成黄色的聚集体。

43、(2)本发明化合物可改变aβ聚集体形态。用透射电镜可观察到，在已聚集的aβ聚集体中加入本发明化合物后，新形成的aβ聚集体呈异于自身纤维状聚集体的短小棒状，或形成了新的聚集体形态，说明化合物对已聚集的aβ聚集体进行了调控重组。对aβ聚集体结构检测表明，本发明化合物破坏了原有aβ聚集体的β-sheet结构，同时新的聚集体为非β-sheet结构。对aβ聚集体存在形式的统一，有利于吞噬细胞的清除作用。

44、(3)本发明化合物可促进巨噬细胞吞噬并降解aβ。激光共聚焦显微成像可观察到，aβ荧光斑块逐渐被巨噬细胞摄取吞噬。流式细胞术结果表明，巨噬细胞吞噬aβ的比例可达85.3％。蛋白免疫印迹结果表明，化合物可有效促进巨噬细胞对aβ的降解。