调控丹参CYP71BE37基因表达的生物材料及其应用

本发明生物育种，具体涉及调控丹参cyp71be37基因表达的生物材料及其应用。

背景技术：

1、丹参(salvia miltiorrhiza bunge)是我国的常用大宗中药材，素有“一味丹参，功同四物”之称，具有活血化瘀、清心除烦、养心安神等功能，广泛应用于心血管疾病的治疗。水溶性丹酚酸类和脂溶性丹参酮类化合物为丹参的主要活性成分。丹参酮类化合物为二萜醌类，是唇形科鼠尾草属植物中的特征性成分。近年来由于市场需求不断扩大，野生资源被大量采挖，使得生态平衡造成破坏。而目前市场上丹参供应主要依靠于人工栽培，使得丹参品种鱼龙混杂，各地加工稂莠不齐，没有形成良好的栽培及加工规范，丹参的药材质量和药用价值都有大幅度的降低。因此，研究其生物合成途径对于中药“道地性”形成机理和唇形科二萜类化合物的多样性进化机制具有重要的意义。

2、细胞色素p450在萜类化合物的结构修饰中发挥重要作用，90％以上的萜类化合物需要经过p450的氧化修饰，生成活性化合物或者作为进一步结构修饰的底物。p450是植物中最大的酶基因家族，约占植物编码蛋白的1％，同时由于p450催化反应的复杂性，为鉴定特定次生代谢产物生物合成的p450带来了巨大的挑战。课题组前期已经鉴定丹参酮途径中关键酶基因，cyp76ah1能够催化前体次丹参酮二烯羟基化和芳构化，生成铁锈醇(guo j,zhou yj，hillwig ml，shen y,yang l,wang y,zhang x,liu w,peters rj,chen x,zhaozk,huang l(2013)cyp76ah1 catalyzes turnover of miltiradiene in tanshinonesbiosynthesis and enables heterologous production of ferruginol in yeasts.procnatl acad sci u s a.110(29):12108-13)。rnai实验表明，抑制该基因的表达导致丹参毛状根中次丹参酮二烯积累，而铁锈醇以及丹参酮类化合物含量显著下降，从而验证了该基因在丹参体内的功能(ma y,ma x h,meng f y,zhan z l,guo j,huang l q(2016)rnainterference targeting cyp76ah1in hairy roots of salvia miltiorrhiza revealsits key role in the biosynthetic pathway of tanshinones.biochem biophys rescommun 477:155-160)。cyp76ah3能够进一步催化铁锈醇c11位羟基化或c7位的氧化，分别生成11-羟基铁锈醇和柳杉酚，并进一步将这两个产物催化生成11-羟基柳杉酚。cyp76ak1继续在c11和c12羟基化产物的基础上催化c20的羟基化，最终形成10-羟甲基四氢丹参新酮和11，20-二羟基柳杉酚(guo j,ma x,cai y,ma y,zhan z,zhou yj,liu w,guan m,yangj,cui g,kang l,yang l,shen y,tang j,lin h,ma x,jin b,liu z,peters rj,zhao zk,huang l(2016)cytochrome p450promiscuity leads to a bifurcating biosyntheticpathway for tanshinones.new phytol 210:525-534)。这些产物已通过酿酒酵母实现了高效生产，为后续丹参酮类化合物生物合成途径的解析提供了重要的基础。进一步通过全基因组扩张分析，rnai干扰和代谢组学分析，确定4个cyp71d家族基因与呋喃环类化合物的合成密切相关，最终通过生化功能分析确定了2个基因参与丹参酮类化合物呋喃环的生物合成(ma y,cui g h,chen t,ma x h,wang r s,jin b l,yang j,kang l p，tang j f,laic j s,wang y n,zhao y j,shen y,zeng w,peters r j,qi x q,guo j,huang l q(2021)expansion within the cyp71d subfamily drives the heterocyclization oftanshinones synthesis in salvia miltiorrhiza.nat commun 12:685)。

3、随着crispr/cas9等分子生物学及基因工程等手段的不断发展，对丹参酮类成分合成途径中关键酶基因进行敲除，成为研究其代谢网络的有效手段。进一步利用分子育种等手段改善丹参药材品质，培育含有丰富药效成分丹参品种是迫在眉睫的事情。而目前的研究中对此方面研究关注较少。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：如何调控丹参中的丹参酮类化合物的含量。例如如何提高丹参中二氢丹参酮i，四氢丹参酮i，隐丹参酮，丹参酮iia，丹参新酮的含量。

2、为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种应用，所述应用可为蛋白质或调控所述蛋白质表达的生物材料或调控所述蛋白质活性或含量的生物材料在下述任一项中的应用：

3、a1)、在调控植物丹参酮类化合物合成中的应用；

4、a2)、在制备调控植物丹参酮类化合物合成的产品中的应用；

5、a3)、在调控植物隐丹参酮合成中的应用；

6、a4)、在制备调控隐丹参酮合成的产品中的应用；

7、a5)、在调控植物丹参酮iia合成中的应用；

8、a6)、在制备调控丹参酮iia合成的产品中的应用；

9、a7)、在调控植物丹参新酮合成中的应用；

10、a8)、在制备调控丹参新酮合成的产品中的应用；

11、a9)、在调控植物二氢丹参酮i合成中的应用；

12、a10)、在制备调控二氢丹参酮i合成的产品中的应用；

13、a11)、在调控植物四氢丹参酮i合成中的应用；

14、a12)、在制备调控四氢丹参酮i合成的产品中的应用；

15、a13)、在植物育种或植物辅助育种中的应用；

16、a14)、在制备植物育种或植物辅助育种的产品中的应用；

17、所述蛋白质可为如下任一种：

18、b1)、氨基酸序列是seq id no.2的蛋白质；

19、b2)、b1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与b1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且与丹参酮酶催化活性相关的蛋白质；

20、b3)、在b1)或b2)的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质。

21、进一步地，所述的应用中，所述蛋白质可来源于丹参(salvia miltiorrhiza)。

22、进一步地，所述的应用中，所述植物育种的考量指标可为丹参酮的含量。

23、进一步地，所述的应用中，所述植物育种的目的可为获得丹参酮的含量提高的植物。

24、本发明中，b1)所示蛋白质由498个氨基酸残基组成。

25、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

26、所述蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag蛋白标签、his蛋白标签、mbp蛋白标签、ha蛋白标签、myc蛋白标签、gst蛋白标签和/或sumo蛋白标签等。

27、本发明中，所述植物育种或辅助育种的指标可为丹参酮含量。

28、本发明中，所述植物育种或辅助育种的目的可为获得丹参酮含量提高的植物。

29、本发明中，所述调控可为促进或提高。本发明中，所述调控也可为抑制或降低。

30、进一步地，所述的应用中，所述生物材料可为下述任一项：

31、c1)、抑制或降低上述蛋白质的编码基因表达的核酸分子或抑制或降低上述蛋白质的活性或含量的核酸分子；

32、c2)、含有c1)所述核酸分子的表达盒；

33、c3)、含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；

34、c4)、含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物；

35、c5)、含有c1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有c2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有c3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

36、c6)、含有c1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有c2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有c3)所述重组载体的转基因植物组织；

37、c7)、含有c1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有c2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有c3)所述重组载体的转基因植物器官；

38、c8)、编码上述蛋白质的核酸分子；

39、c9)、含有c8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

40、进一步地，所述的应用中，c1)所述核酸分子可为靶向上述应用中所述蛋白质的编码基因的grna或转录所述grna的基因。

41、进一步地，所述的应用中，所述grna的靶标序列的核苷酸序列是seq id no.1第344-363位(5’-ggtccaccagcatcacgttc-3’)。

42、进一步地，所述的应用中，所述grna的核苷酸序列是seq id no.4。

43、进一步地，所述的应用中，c8)所述核酸分子可为如下g1)或g2)所述的dna分子：

44、g1)、编码链的核苷酸序列是seq id no.1的dna分子；

45、g2)、编码链的编码序列是seq id no.1的dna分子；

46、g3)、与g1)或g2)所述dna分子具有80％以上的同一性，且调控植物丹参酮类化合物合成的dna分子；

47、进一步地，所述的应用中，c2)所述表达盒可为在crispr/cas9载体的自有表达盒上插入包含所述靶标序列的dna分子。

48、进一步地，所述的应用中，c3)所述重组表达载体可为重组的crispr/cas9载体。

49、在本发明的一个实施例中，所述重组的crispr/cas9载体可为pcambia1300-p13载体，pcambia1300-p13载体的模板链的核苷酸序列是seq id no.3。其中seq id no.3第3484448位是cas9蛋白的编码序列(cds)。seq id no.3第4079 5054位是camv 35s启动子。seqid no.3第5552 5647位是sgrna基因(其中第5552 5627位是sgrna基因的骨架序列，第56285647位是spacer序列)。seq id no.3第5670 6090位是atu6-26sk启动子。sgrna的核苷酸序列是seq id no.4。pcambia1300-p13载体中sgrna由atu6-26sk启动子驱动转录，cas9蛋白由camv 35s启动子驱动表达。

50、进一步地，所述的应用中，c4)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。

51、进一步地，所述的应用中，c6)所述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。

52、进一步地，所述的应用中，c7)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

53、进一步地，所述的应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。

54、进一步地，所述的应用中，所述植物选自下述任一种：

55、d1)、双子叶植物；

56、d2)、唇形目植物；

57、d3)、唇形科植物；

58、d4)、鼠尾草属植物；

59、d5)、丹参(salvia miltiorrhiza)。

60、上述应用中，所述调控基因表达的核酸分子可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

61、上述应用中，所述调控基因表达可为抑制或降低所述基因表达，所述抑制或降低所述基因表达可通过基因敲除实现或通过基因沉默实现。

62、所述基因敲除(gene knock out)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过dna序列的改变使特定靶基因失活。

63、所述基因沉默是指在不损伤原有dna的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变dna序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于dna甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标rna进行特异性抑制而使基因失活，包括反义rna、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、rna干扰(rnai)和微小rna(mirna)介导的翻译抑制等。

64、第二个方面，本发明提供提高丹参中丹参酮类化合物含量的方法，所述方法可包括敲除丹参基因组中的上述蛋白质的编码基因，提高丹参中丹参酮类化合物的含量。

65、第三个方面，本发明提供制备丹参酮类化合物含量提高的丹参的方法，所述方法可包括敲除丹参基因组中的上述蛋白质的编码基因，得到丹参酮类化合物含量提高的丹参。

66、进一步地，所述的方法中，所述敲除丹参基因组中的上述的蛋白质的编码基因包括将靶向上述的蛋白质的编码基因的grna基因和cas9基因导入受体丹参或丹参组织或者器官中，得到上述的蛋白质的编码基因敲除的丹参或者丹参组织或器官。

67、进一步地，所述的方法中，所述蛋白质的编码基因可为所述蛋白质的编码序列所在基因组的基因。

68、进一步地，所述的方法中，所述grna的靶标序列的核苷酸序列是seq id no.1第344-363位(5’-ggtccaccagcatcacgttc-3’)。

69、进一步地，所述的方法中，所述grna的核苷酸序列是seq id no.4。

70、进一步地，所述的方法中，所述grna基因和cas9基因通过pcambia1300-p13载体导入受体丹参(或者受体丹参组织)中，pcambia1300-p13载体中sgrna由atu6-26启动子驱动转录，cas9蛋白由35s启动子驱动表达。

71、进一步地，所述的方法中，所述敲除丹参基因组中的上述的蛋白质的编码基因可包括如下任一项所述的突变:

72、(1)将丹参基因组的两条同源染色体中核苷酸序列是seq id no.1的基因第353位和359位核苷酸之间的5个碱基缺失；

73、(2)将丹参基因组的两条同源染色体中核苷酸序列是seq id no.1的基因第358位和364位核苷酸之间的5个碱基缺失；

74、(3)将丹参基因组的两条同源染色体中核苷酸序列是seq id no.1的基因第356位和361位核苷酸之间的4个碱基缺失；

75、第四个方面，本发明提供上述应用中的所述蛋白质。

76、第五个方面，本发明提供上述应用中的所述生物材料。

77、本发明中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

78、上述80％或80％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

79、所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述85％以上的同一性可为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。所述95％以上的同一性可为至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。本发明取得的有益技术效果如下：

80、本发明基于丹参全基因组数据，对p13基因家族进行鉴定和表达分析，筛选出可能调控丹参酮i成分的候选基因，构建了含有p13基因的crispr/cas9载体。通过发根农杆菌c58c1介导的丹参遗传转化获得转基因阳性毛状根。利用实时荧光定量pcr检测p13基因在p13敲除突变体中的基因表达水平。对p13阳性突变体和野生型进行转录组测序，进一步检测丹参酮途径中关键酶基因的转录水平。利用lc-qtof-ms化学检测p13敲除株系中丹参酮类化合物的变化。结果表明丹参酮类化合物如隐丹参酮，二氢丹参酮i，四氢丹参酮i，丹参酮iia，丹参新酮较野生型均显著升高，而丹参酮i和1，2-二氢丹参醌等化合物含量降低或无明显变化，因此推测p13基因在丹参酮i生物合成途径中具有重要作用。本发明提供的p13基因具有提高丹参酮类化合物合成的功能，因此在生产有效的活性物质等方面具有应用价值，以及为解析植物次生代谢途径分子机制奠定了基础。

81、本发明利用crispr/cas9技术提供了丹参cyp71be37(p13)基因的一种新用途：在提高丹参酮含量中的应用，构建高产丹参酮类化合物(除丹参酮i外)的株系。

82、本发明首次发现p13基因在调控丹参酮含量中的用途，揭示了p13基因具有提高丹参酮类化合物合成的功能，在生产有效的活性物质等方面具有应用价值，以及为解析植物次生代谢途径分子机制奠定了基础。