利用牛血清生产超低Ig牛血清和IgG的方法与流程

本发明属于生物制品，具体涉及利用牛血清生产超低免疫球蛋白（ig）牛血清和igg的方法。

背景技术：

1、牛血清中含有丰富的蛋白质、营养物质和生物活性物质，是常用的血清添加剂，是细胞培养中重要的天然培养基，常用于动物细胞的体外培养。它可以支持细胞的生长、增殖和分化，并提供必要的血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，有助于细胞培养和实验室中的细胞研究。牛血清广泛应用于许多领域，包括生物科学研究、医药工业、生物技术和生物制药等。在医药工业生物制药领域中，牛血清常被用于生产生物制剂和药物。它可以作为生产疫苗、抗体、生物治疗药物等的原料，为这些制品提供必要的生长因子和营养物质。它可以用作生物反应器的培养基成分，为生物过程提供所需的营养物质和环境条件。牛血清可以用于蛋白质表达、酵母表达系统和细胞培养等领域，为生产重组蛋白和生物药物提供必要的条件和辅助物质。但是，由于牛血清的来源是动物，所以存在一定的风险，如感染病原体或导致过敏反应。因此高质量的牛血清在市场上需求很大。

2、免疫球蛋白（immunoglobulin，ig）又称为抗体，普遍存在于哺乳动物的血液、组织液、淋巴液及外分泌物中，是人类及高等动物受抗原刺激后体内产生的能与抗原特异性地相互作用的一类蛋白质，是由两条相同的轻链和两条相同的重链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构，根据该结构的不同，可将ig分为5类 ，即igg，iga，igm，igd及ige，igg为血清中免疫球蛋白的主要成分，在免疫系统中发挥重要作用，如抗菌，中和病毒、对于结缔组织病、白血症、肝脏病、代谢性疾病、传染病等都有重要的意义。但是，新生牛血清中的免疫球蛋白对细胞有毒性作用，可能严重影响细胞的生长和病毒性疫苗的质量。

3、igg是一种免疫球蛋白的亚类，是体内最常见的免疫球蛋白。igg是由两个重链和两个轻链组成的y型分子，可以通过结合到病原体表面的抗原来触发免疫反应。它在体内发挥多种重要的免疫功能，包括中和病原体、促进炎症反应、调节免疫细胞的活性等。igg也参与免疫记忆的形成。在初次感染或疫苗接种后，机体会产生特定的igg抗体，对再次暴露于同一病原体时提供快速和强力的免疫保护。牛血清中的igg会干扰细胞培养和干扰疫苗生产中的病毒生长。牛血清中的igg可能与特定抗原结合，形成抗原-抗体复合物。这些复合物可以与细胞表面的fc受体结合，并激活免疫细胞，激活的免疫细胞可能会释放细胞毒素，对周围的细胞产生毒性作用，从而干扰细胞培养的正常生长。牛血清中的igg可能具有中和病毒的能力，即通过与病毒结合并阻止其进入细胞。在疫苗生产中，如果牛血清中的抗体对病毒具有中和作用，将阻碍病毒感染细胞并进行繁殖，从而影响疫苗的质量。

4、免疫球蛋白m（igm）是属于人类免疫系统中的抗体家族之一。igm是一种早期产生的巨大抗体，参与免疫应答的初始阶段。它具有凝集病原体、激活补体和引发炎症反应等功能。尽管在后续免疫反应中被其他抗体替代，但igm在免疫系统中扮演着重要的角色。igm相对于其他类型的抗体，其分子量较大，这使得牛血清中的igm具有较高的粘度和凝集性。高粘度的血清可能会导致在操作和处理过程中出现困难，影响疫苗或生物制品的制造过程。由于igm的大尺寸和复杂结构，它在一些条件下可能更容易发生变性、凝聚或沉淀。这可能导致牛血清的不稳定性，影响其质量和保质期。igm是免疫系统早期应答的重要成分，在感染或免疫刺激后迅速产生。如果牛血清中含有高水平的igm，可能表示存在免疫反应或慢性感染，这可能影响血清的用途和质量。在制备生物制品和疫苗时，牛血清常被用作培养基和辅助成分。因此，在生产过程中，通常会对牛血清进行处理和纯化，以减少其中的igm含量，从而提高制品的质量和稳定性。

5、在生物制品企业的研发和生产过程中，胎牛血清常被用作细胞培养基的重要组分。然而，由于进口胎牛血清价格昂贵且国内产量有限，这导致了供应不稳定和生产成本的上升。国产新生牛血清价格更为经济实惠，货物供应更稳定。通过采用国产新生牛血清，可以有效降低生产成本，提高产品的竞争力。国内生产的新生牛血清不受进口限制和国际市场波动的影响，够提供更为可靠的货源，并确保生产过程的连续性和一致性。相较于胎牛血清，新生牛血清中的igg含量较高，这可能会影响产品的质量和产量。然而，通过优化培养条件和改善纯化工艺等策略，可以克服这些影响并确保产品的质量和产量达到所需的标准。随着国内生产技术的不断进步和改进，国产新生牛血清将成为替代进口胎牛血清的可行选择，为生物制品企业提供可持续发展的解决方案。

6、目前常用的牛血清中分离免疫球蛋白的方法包括碱洗法、乙醇沉淀法、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱法等。例如中国专利文献cn110804578a曾公开了乙醇沉淀法、层层过滤和层析的手段去除牛血清中的igg，该方法步骤繁琐，需要精确控制乙醇的浓度和温度等条件，并且一定程度上会有igg损失或无法完全回收，降低了分离的产量和效率。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种超低ig牛血清生产工艺，可以在高ig去除率的基础上同时解决igg的回收问题，该方法工艺稳定且适用于大批量生产，能达到很高的效率和纯度。其包括以下步骤：

2、一）用mabselect sure作为吸附剂，将牛血清过滤后以160-250cm/h的流速经mabselect sure层析柱上样，当峰图曲线上升直至斜率变为0时，收集流穿液，当曲线斜率变为负数时，停止收集；

3、二）将所收集流穿液以150-200cm/h的流速经同一层析柱再次上样，当峰图曲线上升直至斜率变为0时，收集流穿液，当曲线斜率变为负数时，停止收集，得到低免疫球蛋白牛血清。

4、三）收集得到低免疫球蛋白牛血清后，冲洗、洗涤和平衡层析柱，然后以150-200cm/h的流速用洗脱液洗脱层析柱 2-3个柱体积，当紫外吸收值大于0.05时进行收集，当紫外吸收值小于0.05时停止收集，得到igg。

5、牛血清来源：可以选择未进食的新生公牛，检查幼牛档案，剃毛并消毒。采集全血，离心分离牛血清；也可直接购买国产新生牛血清作为实验材料。

6、优选的所述mabselect sure吸附剂颗粒大小为75μm。优选的mabselect sur吸附剂每ml介质载量为10mg/ml。可以将牛血清通过elisa或者液相色谱法测得供试品牛血清中的igg含量，假设测得含量为a mg/ml，所用层析柱的容积为b ml，两次连续过滤所流穿的最大体积控制在10b/a ml，避免免疫球蛋白损失。

7、将牛血清通过0.45μm滤膜过滤，得到样品1，此步骤是在除菌的同时增加层析介质寿命，从而实现高利用率的生产要求。

8、优选的，提供一种超低ig牛血清生产工艺，可以包括以下步骤：

9、1)将牛血清通过0.45μm滤膜过滤，得到样品1；

10、2)用清洗缓冲液 以150-200cm/h的流速清洗2个柱体积，用再生液以150-200cm/h的流速再生层析柱2个柱体积；

11、3) 用清洗缓冲液 以150-200cm/h的流速平衡层析柱5倍柱体积；

12、4) 将样品1以160-250cm/h的流速上样，当峰图曲线上升直至斜率变为0时，收集流穿液，当曲线斜率变为负数时，停止收集，得到样品2；

13、5) 样品2搅匀后，以150-200cm/h的流速上样，当峰图曲线上升直至斜率变为0时，收集流穿液，当曲线斜率变为负数时，停止收集，得到样品3；

14、6）然后以150-200cm/h的流速用清洗缓冲液冲洗层析柱2倍柱体积，使紫外吸收值降至基线;

15、7) 以150-200cm/h的流速用高盐洗涤液洗涤层析柱3倍柱体积,以70-80cm/h的体积流速用缓冲液a平衡层析柱2倍柱体积;

16、8) 以150-200cm/h的流速用洗脱液洗脱层析柱3个柱体积，当紫外吸收值大于0.05时收集洗脱液，当紫外吸收值小于0.05时停止收集，得到样品4;

17、9）在超净台中使用0.22μm滤膜过滤样品3，得到样品5;

18、10）将样品4低ph孵育除菌得到样品6。

19、优选的，步骤4）中所述上样流速第一次为190-210cm/h，步骤5）中所述上样流速为180-200cm/h。

20、优选的，所述清洗缓冲液为20mmol/l 磷酸缓冲液（pb），ph7；再生液为0.1mol/l醋酸；高盐洗涤液为50mmol/l醋酸－醋酸钠缓冲液（hac-naac），0.5mol/l 氯化钠溶液（nacl），ph5.5；洗脱液为0.1m 甘氨酸-盐酸缓冲液（gly-hcl），ph3.0。

21、进一步的，所述步骤10）中将样品4的ph调到6，0.02μm过滤后得到样品6，保存于4℃。

22、进一步的，步骤8)之后，将层析柱介质2℃-8℃保存于保存液20mmpb+20%乙醇中，ph为7.0。

23、优选的，层析柱的柱高选用14.5cm，柱子容积为29ml。

24、进一步的，可以将样品6用1mol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸ph8.0溶液或0.5mol/l盐酸溶液调节ph至3.5±0.1，室温放置60±5分钟，孵育后用1mol/l三羟甲基氨基甲烷-盐酸ph8.0溶液将ph调整至5.4±0.1，在超净台中用0.22μm滤膜预冲洗500ml注射用水后过滤澄清后2~8℃保存。

25、本发明利用mabselect sure作为亲和层析固定相，它可以特异性地结合和纯化单克隆抗体，而对其他蛋白质和杂质的结合能力较低，从而降低了洗脱组分中的杂质水平。该物质具有良好的流体动力学性能，能在高流速下进行操作。这有助于我们快速分离和纯化抗体，缩短操作时间，提高工艺效率。该物质能够耐受多种洗脱条件，包括酸性和碱性条件。可以使用经济高效的试剂（如氢氧化钠）进行清洁，而无需使用昂贵且有害的清洁剂（如gua-hcl）。我们通过工艺的优化，使其具有能够处理大量的样品，提高了产量和生产效率。

26、相比起传统的超低igg牛血清制备工艺，本发明对igg、igm的去除率有显著改进，igg去除率提高至99.9％以上，igm去除率大于19%。本发明在获得低ig的、符合更高质量要求的牛血清的同时，实现了igg的回收利用，通过获得牛血清和回收igg的高效组合，大大提高了超低ig牛血清的质量和产量，缩短了制备时间，同时也保证了回收igg的纯度。该工艺省时高效，经济适用，环境友好，比现有技术有着显著的进步，带来更高的经济和社会效益。