用于保护氧敏感革兰氏阳性菌的REG3α的制作方法

【】本发明涉及一种用于保护氧敏感革兰氏阳性菌的多肽、包含所述多肽的组合物及其用途，以及此多肽用于促进氧敏感革兰氏阳性菌离体生长的用途。

背景技术

0、
背景技术：

1、在哺乳动物并且尤其是人类中，微生物群包括微生物，如细菌、病毒、真菌和古细菌(单细胞微生物)，并且可以在皮肤(包括真皮和真皮脂肪组织)上，在嘴、鼻子、呼吸道、消化道和生殖系统中发现。微生物群不仅与其宿主有共生关系，而且还与其宿主有互利关系，因为它在局部和远程保存器官、组织和免疫内稳态。微生物群执行几项任务，其中包括营养功能(上皮细胞更新、肠动力、肠壁结构、粘膜成熟、厚度、结构等)、代谢功能(脂肪沉积、消化、能量代谢控制)以及还有防御功能(抗菌免疫、paneth细胞分化、外源细菌或病原体的屏障)，并且在正常情况下，它们不会对宿主造成疾病或失调(disorder)。在异常情况(例如像炎症)下，微生物群中存在不平衡，并且所述微生物群可以影响宿主防御和免疫，并且进而可能变得致病并导致失调和/或疾病的开始或恶化。这在消化道微生物群中尤其明显。

2、我们的肠道微生物群含有数十万亿种微生物，包括至少1000种不同种类的已知细菌，其基因多于300万个。微生物群的总重量可以高达2kg。我们肠道微生物群的三分之一是大多数人共有的，而三分之二是我们每个人特有的。在哺乳动物并且特别是在人类中，肠道微生物群是微生物的群落，居住在胃肠道的长度和宽度上。这种微生物群落的组成是宿主特异性的。每个人的肠道微生物群都可以经历内源性和外源性的改变。它也被称为人类菌群、微生物组、微生物群或肠道菌群。在人类中，肠道微生物群是在出生后一到两年建立的，并且到那时，其所分泌的肠上皮和肠粘膜屏障已经以一种耐受并且甚至支持肠道微生物群的方式共同发展，并且还提供了对病原生物体的有效屏障。肠道微生物群从婴儿期不成熟和不稳定的生态系统演变成成年期更复杂和稳定的生态系统。人类和肠道微生物群处于共生关系，并且肠道微生物群通过双向信号传导与其宿主相互作用，将其连接到肠外器官(脑、肝)，并影响其健康和代谢，这可能导致代谢疾病。

3、肠道微生物群起着许多重要的作用，包括消化、代谢、营养提取、维生素合成、防止病原体定殖和调节免疫系统。

4、在健康人的肠道微生物群中，有益细菌与潜在有害或致病细菌之间存在平衡。健康问题始于肠道微生物群失衡(例如由于抗生素治疗)时。

5、如果有害细菌的量大大增加，则可能出现各种症状和病理状态。这种不平衡被称为生态失调或菌群失调。它是指已在肠道中定殖的微生物菌群数量或类型的不平衡。这在消化道中最常见，但也可能发生在有细菌存在并活跃的人体的任何暴露表面或粘膜上。旨在鉴定微生物群中具有促进免疫成熟或炎症能力的单个细菌成员的研究反复地鉴定类似的物种或生物组，如普雷沃氏菌科(prevotellaceae)细菌和粘附性侵入性大肠杆菌(aiec)。这些微生物被命名为致病共生菌(pathobiont)，以描述它们对宿主的潜在致病影响。尽管致病共生菌在健康、免疫活性宿主中在没有明显疾病的情况下共存，并显著支持免疫系统的成熟，但在某些情况下，它们的影响可能引发炎症、自身免疫并促进临床疾病的发展。生态失调可能影响消化、营养的吸收、维生素的产生并控制有害微生物的生长。许多因素，如饮食习惯的改变或抗生素的使用，都可能影响微妙的微生物平衡，并且由此导致生态失调。研究人员认为，它可能在失调(如炎症性肠病(ibd)、慢性疲劳、肥胖或某些癌症)中发挥作用。

6、肠道微生物群的组成和/或生物多样性的改变或变化已被证明与微生物群相关的疾病和失调相关，其中有炎症性肠病(ibd)、胃肠感染、肠易激综合征和其他胃肠功能疾病、胃肠道癌、非胃肠癌(pevsner-fischer,role of the microbiome in non-gastrointestinal cancers,world j clin oncol.2016；7(2):200–213)、代谢综合征和肥胖症、急性和慢性肝病、过敏性疾病、自身免疫疾病(kim d.gut microbiota inautoimmunity:potential for clinical applications.arch pharm res.2016)、囊性纤维化(nielsen s,disrupted progression of the intestinal microbiota with age inchildren with cystic fibrosis.sci rep.2016may 4；6:24857；duytschaeverg.dysbiosis of bifidobacteria and clostridium cluster xiva in the cysticfibrosis fecal microbiota.j cyst fibros.2013；12(3):206-15)、特应性皮炎和神经系统疾病，如自闭症(ianiro等人,curr drug targets 2014；15(8):762-70)、焦虑症、抑郁症和慢性疼痛(mayer,gut microbes and the brain:paradigm shift inneuroscience.the journal of neuroscience,2014,34(46):15490-15496)。

7、生态失调可以定义为与健康个体的组成和功能内稳态相比，疾病期间发生的微生物群状态的改变。目前，生态失调被视为微生物-宿主串扰改变的标志，并且是旨在恢复或维持肠道功能内稳态的策略的主要目标。尽管明显受限于微生物群的组成和多样性，但生态失调被怀疑是多种肠道和肠道外疾病的关键致病因素。然而，微生物群失衡，包括粘膜水平上微生物生物量的增加、免疫攻击性细菌(基本上为革兰氏阴性)比例的增加以及相反的免疫保护性细菌(基本上为革兰氏阳性)比例的降低，触发了自动放大的恶性循环。

8、肠道微生物群在微生物群相关疾病和失调管理方面的调节是其治疗和/或预防的有希望的方法。现有技术涉及益生菌、益生元、抗微生物剂、肥胖外科手术和减肥策略的使用(omotayo等人,int j mol sci.2014mar；15(3):4158–4188)。

9、人分泌的c型凝集素reg3α，也称为肝癌-肠-胰腺/胰腺炎相关蛋白(hip/pap)，是一种16kda碳水化合物结合蛋白，其在许多真核细胞类型和组织中表现出抗炎活性。其在生理条件下在paneth细胞和小肠的神经内分泌细胞中表达，并在大肠中响应于感染和炎症。

10、已知reg3α的截短变体是抗炎剂和/或抗菌剂(us 7,923,014和us 8,212,007)。

11、发明人已惊奇地发现，与已知的抗菌活性相反，reg3α多肽允许保护氧敏感革兰氏阳性菌。因此，本发明依赖于以下事实：多肽reg3α对氧敏感革兰氏阳性菌，并且特别是肠道微生物群的有益共生体具有保护作用。

技术实现思路

0、
技术实现要素：

1、本发明涉及一种用于保护氧敏感革兰氏阳性菌的reg3α多肽，其包含氨基酸序列seq id no:4或与其至少85％相同的序列。

2、还提供了一种用于口服或经粘膜施用的药物组合物，其包含reg3α多肽，所述多肽包含氨基酸序列seq id no:4或与其至少85％相同的序列，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

3、本发明还涉及上述组合物用于预防或治疗微生物群相关疾病和/或失调的用途。

4、根据另一个方面，本发明涉及包含氨基酸序列seq id no:4或与其至少85％相同的序列的reg3α多肽用于促进氧敏感革兰氏阳性菌离体生长的用途。

5、还提供了包含氨基酸序列seq id no:4或与其至少85％相同的序列的reg3α多肽用于制备食品的用途。

6、本发明的说明

7、发明人已经证实，转基因小鼠胃肠道(git)内腔中hreg3α凝集素浓度的增加诱导肠道微生物群组成的显著变化，并显著提高宿主对肠道炎症的抵抗力。事实上，暴露于dss(葡聚糖硫酸钠)的hreg3α转基因小鼠几乎没有表现出结肠炎的迹象，保持了紧密的粘膜屏障并实现了完全存活。在结肠炎期间，hreg3α对肠上皮细胞具有强有力的抗氧化活性，并且特别是重组人reg3α(rcreg3α)的ros清除活性作用于原核细胞，特别是通过促进高氧敏感细菌的存活。

8、由纯合hreg3α转基因小鼠在稳态和炎症条件下表现出的微生物变化主要包括梭菌属(clostridiales)(瘤胃菌科(ruminococcaceae)、毛螺菌科(lachnospiraceae))的富集和拟杆菌属(bacteroidetes)(普雷沃氏菌科)的耗竭。由于反复静脉施用rcreg3α不能改善wt小鼠的dss诱导的结肠炎，因此放弃了全身抗结肠源性作用。发明人证实，hreg3α为肠上皮和形成肠道微生物群的共生群落二者提供了抗氧化应激的保护。发明人还证实，在抗生素治疗后，hreg3α转基因小鼠更好地抵抗dss诱导的结肠炎。

9、因此，本发明提供了一种用于保护氧敏感革兰氏阳性菌的reg3α多肽，其包含氨基酸序列seq id no:4或与其至少85％相同的序列。

10、还提供了一种保护氧敏感革兰氏阳性菌的体内或离体方法，其包括将氧敏感革兰氏阳性菌与包含氨基酸序列seq id no:4或与其至少85％相同的序列的reg3α多肽接触。

11、如本文所用，“reg3α多肽”表示再生胰岛衍生蛋白3-α，其是与c型凝集素超家族相似的胰腺分泌蛋白。在一个实施方案中，reg3α多肽是哺乳动物reg3α，特别是灵长类动物(优选人)或啮齿类动物(如大鼠或小鼠)reg3α。reg3α可以是天然reg3α或其天然存在或工程化变体。

12、在本发明的上下文中，reg3α多肽包含氨基酸序列seq id no:4或与其至少85％相同的序列。氨基酸序列seq id no:4是胰蛋白酶截短的成熟hreg3α的序列。根据一个实施方案，reg3α多肽包含氨基酸序列seq id no:1或与其至少85％相同的序列。根据另一个实施方案，reg3α多肽包含氨基酸序列seq id no:2或与其至少85％相同的序列。根据另一个实施方案，reg3α多肽包含氨基酸序列seq id no:3或与其至少85％相同的序列。

13、氨基酸序列seq id no:1是hreg3α及其信号肽(对应于氨基酸1-26的信号肽)的序列。在体内，序列seq id no:1的hreg3α被加工以去除信号肽并形成成熟的hreg3α。成熟的hreg3α具有氨基酸序列seq id no:3的序列。

14、在用胰蛋白酶进行蛋白水解切割后，从成熟蛋白reg3α的n-末端去除了11个氨基酸。

15、氨基酸序列seq id no:4是胰蛋白酶切割后天然存在的成熟蛋白hreg3α的序列；其对应于seq id no:3，其中11个第一氨基酸已被删除。

16、氨基酸序列seq id no:2是hreg3α的序列，其中肽信号序列已被甲硫氨酸替代。此序列对应于重组成熟蛋白。

17、如本文所用的术语“包含其氨基酸序列的reg3α多肽”是指包含与氨基酸序列seqid no:4至少85％、或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述多肽包含与氨基酸序列seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3具有至少85％、或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。

18、氨基酸序列同一性定义为在比对序列并且必要时引入间隙以实现最大序列同一性百分比，并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后，序列中与参考序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。序列同一性可以在分析序列的全长、参考序列的全长或二者上确定。蛋白质序列的同一性百分比可以通过以下来计算：例如使用needle，并使用间隙开放罚分为10和间隙延伸罚分为0.5的blosum62矩阵，基于needman-wunsch比对算法执行成对全局比对，以找到两个序列沿其整个长度的最佳比对(包括间隙)。

19、根据一个实施方案，所述reg3α多肽保护氧敏感革兰氏阳性菌免受一种或多种以下情况的影响：

20、(i)肠道炎症；

21、(ii)暴露于氧气，特别是活性氧物种。

22、根据一个实施方案，所述reg3α多肽允许产生丁酸盐的细菌以及作为抗炎化合物的丁酸盐浓度的存活和生长增加。因此，所述reg3α多肽允许减少炎症。

23、如本文所用的术语“氧敏感革兰氏阳性菌”是指氧敏感的革兰氏阳性菌，例如梭菌目(clostridiales order)的革兰氏阳性成员，优选瘤胃菌科(ruminocaccaceae family)和/或毛螺菌科(lachnospiraceae family)的革兰氏阳性菌，最优选地它们来自粪杆菌属(faecalibacterium genus)和/或罗斯氏菌属(roseburia genus)，并且更特别地它们是普拉梭菌(faecalibacterium prausnitzii)和/或肠道罗斯氏菌(roseburiaintestinalis)。在一个优选实施方案中，“氧敏感革兰氏阳性菌”是产生丁酸盐的细菌。在一个特定实施方案中，“氧敏感革兰氏阳性菌”是已知产生丁酸盐的肠细菌。

24、治疗应用

25、根据本发明的另一个方面，如上定义的reg3α多肽用于预防或治疗微生物群相关疾病和/或失调。

26、还提供了一种预防或治疗微生物群相关疾病和/或失调的方法，其包括向有需要的宿主施用如上定义的reg3α多肽。

27、如本文所用，术语“预防”是指部分或完全预防或延迟微生物群相关疾病和/或失调的一种或多种症状或特征发作的任何方法。可以向没有表现出微生物群相关疾病和/或失调的迹象的受试者施用预防。

28、如本文所用，术语“治疗”是指用于部分或完全缓解、减轻、抑制和/或减少一种或多种症状或特征的发生率和/或延长患有微生物群相关疾病和/或失调的个体的寿命的任何方法。在一些实施方案中，可以向仅表现出微生物群相关疾病和/或失调的早期迹象的受试者施用治疗。

29、如本文所用的受试者涉及动物，并且优选地涉及哺乳动物。更优选地，受试者是啮齿动物，并且最优选地是小鼠或大鼠。在本发明的另一个实施方案中，受试者是灵长类动物并且最优选地是人。受试者可能被怀疑患有微生物群相关疾病和/或失调，或者处于发展微生物群相关疾病和/或失调的风险中。

30、如本文所用，术语“微生物群相关疾病和/或失调”是指与微生物群失衡并且特别是与肠道微生物群失衡相关的疾病或失调。“微生物群相关疾病和/或失调”是指选自以下的疾病或失调：炎症性肠病(ibd)、结肠炎、胃肠感染、肠易激综合征和其他胃肠功能性疾病、胃肠道癌症、代谢综合征和肥胖症、糖尿病、肝病、过敏性疾病、神经退行性疾病和心理失调。“微生物群相关疾病和/或失调”还可以指选自以下的疾病或失调：自身免疫性疾病、囊性纤维化、特应性皮炎、神经性疾病(如自闭症)、焦虑症、抑郁症和慢性疼痛。具体地，神经退行性疾病包括阿尔茨海默病和帕金森病。微生物群相关疾病和/或失调可能是由于破坏肠道微生物群平衡的生活方式应激源，如各种类型的药物、抗生素、化学疗法、放射疗法、免疫疗法、营养不良、进食障碍、病、衰老和/或遗传。

31、reg3α多肽诱导肠道微生物群中总拟杆菌门(bacteriodetes)(普雷沃氏菌科)、梭菌科(sutterellaceae)(变形菌门(phylum proteobacteria))、紫单胞菌科(porphyromonadaceae)和拟杆菌科(bacteroidaceae)(拟杆菌门(phylumbacteroidetes))的耗竭。

32、在预防或治疗微生物相关疾病和/或失调的背景下，reg3α多肽可以通过任何合适的施用途径来施用，如口服、静脉内、直肠、舌下、粘膜、鼻、眼、皮下、肌内、透皮、脊髓、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管或淋巴施用。在一个优选实施方案中，reg3α通过口服或经粘膜途径施用。在另一个优选实施方案中，reg3α通过直肠途径施用。

33、优选地，reg3α多肽以药物组合物的形式提供，所述药物组合物包含reg3α多肽和至少一种药学上可接受的赋形剂。

34、优选地将在本发明上下文中使用的药物组合物设计成适合于所选择的施用途径，并且在适当时使用药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂，如分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。

35、如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”是指适合用于与受试者组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的任何赋形剂，与合理的益处/风险比相称。

36、在另一个方面，本发明涉及一种用于口服或经粘膜施用，或用于口服或经粘膜施用的药物组合物，其包含reg3α多肽以及至少一种生理上可接受的赋形剂。所述药物组合物旨在用于口服或经粘膜施用，并且因此包含至少一种适于口服或经粘膜施用的药学上可接受的赋形剂。

37、如本文所用，术语“经粘膜施用”包括通过粘膜的所有类型的施用，并且包括例如直肠、经舌、肺、阴道或鼻施用。优选地，施用类型可以适应微生物群相关疾病和/或失调的类型。在一个优选实施方案中，根据本发明的组合物用于口服或直肠施用，更优选地根据本发明的组合物用于直肠施用。

38、根据本发明的药物组合物可以通过经粘膜施用来施用，并且可以制备成例如速溶片、乳剂、溶液、喷雾剂、凝胶、粘膜粘附片或糊剂、锭剂、舌下片、滴剂、咀嚼片、栓剂或树胶。

39、根据本发明的药物组合物可以合适的药物单位剂型的形式口服施用。本发明的药物组合物可以制备成多种形式，包括片剂、硬或软明胶胶囊、水性溶液、悬浮液和脂质体以及其他缓释制剂，如成型聚合物凝胶。本发明的药物组合物可以制备成胃保护形式，从而允许reg3α多肽通过胃并在肠中释放。

40、根据本发明的药物组合物可以通过直肠施用来施用。本发明的药物组合物可以多种形式制备，包括其中载体为固体的组合物，例如作为单位剂量栓剂。合适的载体包括可可脂和本领域通常使用的其他材料，并且栓剂可以便利地通过以下形成：混合药物组合物与一种或多种软化的或熔融的载体，随后冷却并在模具中成型。

41、这些应用形式中的每一种都可以通过常规已知的制剂方法使用通常用于生产此类制剂的制剂添加剂来生产。用于本发明所述制剂的此类添加剂可以含有佐剂或方便剂等，包括溶剂、缓冲剂、调味剂、甜味剂、填充剂、防腐剂、胶凝剂、载体、稀释剂、表面活性剂和粘膜粘附聚合物。

42、根据本发明可以使用的优选溶剂是醇，尤其是乙醇、脂肪酸酯、甘油三酯、水及其混合物。

43、优选的防腐剂是低级烷基对羟基苯甲酸酯，尤其是甲基和丙基对羟基苯甲酸酯。

44、合适的载体和稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。

45、如在医学领域中熟知的，任何一个受试者的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、待施用的具体化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和同时施用的其他药物。

46、在另一个方面，本发明涉及用于预防或治疗微生物群相关疾病和/或失调的根据本发明的组合物。

47、根据本发明的另一个方面，根据本发明的用于口服或经粘膜施用的reg3α多肽或组合物用于增加肠内丁酸盐的量。

48、非治疗应用

49、先前提到的所有定义也适用于所述非治疗应用。

50、本发明还涉及如上定义的reg3α多肽用于促进氧敏感革兰氏阳性菌离体生长的用途。

51、还提供了一种促进氧敏感革兰氏阳性菌离体生存和/或生长的方法，其包括使氧敏感革兰氏阳性菌与如上定义的reg3α多肽接触。

52、氧敏感革兰氏阳性菌优选地是工业上感兴趣的细菌，如双歧杆菌属、产乳酸物种或任何革兰氏阳性菌。益生菌是活的微生物食品添加剂，其通过改善其肠道微生物平衡有益地影响宿主生物。益生菌的有益效果包括增强上皮屏障，保护免受生理压力，并调节肠道相关淋巴组织。大多数益生菌，特别是双歧杆菌，是对食品生产、储存和消费过程中产生的压力存活率低的敏感微生物。

53、在一个实施方案中，这些细菌在食品和/或膳食补充剂的配制中是特别令人感兴趣的。

54、在一个实施方案中，这些细菌对复杂有机分子如复杂碳水化合物和乳蛋白的生产和/或降解特别令人感兴趣。

55、如本文所用，术语“离体生存力和/或生长”包括发酵罐和/或产品(如食品(例如乳制品))中的生存力和/或生长。事实上，由于活性氧物种(ros)的出现，很难获得高产量的氧敏感革兰氏阳性菌。根据本发明的多肽的使用允许保护氧敏感革兰氏阳性菌免受氧化应激影响，并且因此允许获得更高的产量。

56、如本文所用，术语“促进”包括获得较高产量的氧敏感革兰氏阳性菌，或者使用不太严格的厌氧条件培养氧敏感革兰氏阳性菌，同时获得与使用严格厌氧条件时相似的细菌产量的可能性。

57、在另一个方面，本发明涉及如本文定义的多肽在制备食品，并且特别是乳制品中的用途。

58、在整个本技术中，术语“包括”应被解释为涵盖所有具体提到的特征以及任选的、附加的、未指定的特征。如本文所用，术语“包括”的使用还公开了其中除了特别提到的特征之外不存在任何特征(即，“由……组成”)的实施方案。此外，不定冠词“一个”或“一种”不排除复数。在相互不同的从属权利要求中陈述某些措施的仅有事实并不表示这些措施的组合不能用于获益。

59、本技术的序列如下：

60、seq id no:1：

61、mlppmalpsvswmllsclmllsqvqgeepqrelpsarircpkgskaygshcyalflspkswtdadlacqkrpsgnlvsvlsgaegsfvsslvksignsysyvwiglhdptqgtepngegwewsssdvmnyfawernpstisspghcaslsrstaflrwkdyncnvrlpyvckftd

62、seq id no:2：

63、meepqrelpsarircpkgskaygshcyalflspkswtdadlacqkrpsgnlvsvlsgaegsfvsslvksignsysyvwiglhdptqgtepngegwewsssdvmnyfawernpstisspghcaslsrstaflrwkdyncnvrlpyvckftd

64、seq id no:3：

65、eepqrelpsarircpkgskaygshcyalflspkswtdadlacqkrpsgnlvsvlsgaegsfvsslvksignsysyvwiglhdptqgtepngegwewsssdvmnyfawernpstisspghcaslsrstaflrwkdyncnvrlpyvckftdseq id no:4：

66、ircpkgskaygshcyalflspkswtdadlacqkrpsgnlvsvlsgaegsfvsslvksignsysyvwiglhdptqgtepngegwewsssdvmnyfawernpstisspghcaslsrstaflrwkdyncnvrlpyvckftd