一种用于常见呼吸道感染病毒检测的生物标记物及试剂盒的制作方法

本发明涉及医学和生物，尤其涉及一种用于常见呼吸道感染病毒检测的生物标记物及试剂盒。

背景技术：

1、crispr序列是一个特殊的dna重复序列，包含有高度保守的长度约为21-48bp的重复序列(repeats)和26-72bp的间隔序列(spacer)。重复序列被不同的间隔序列隔开，crispr通过间隔序列对靶基因进行识别。cas位于crispr位点附近，是双链dna核酸酶家族的总称。由规律成簇的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，crispr)和crispr相关蛋白(crispr-associated protein,cas蛋白)组成的crispr/cas系统被认为是存在于大多数细菌与所有古生菌中的一种适应性免疫系统，以消灭外来的遗传物质。随着对crispr/cas系统的作用机制和cas蛋白功能的逐步揭示，crispr/cas系统逐渐发展成为一种由引导rna指引cas核酸酶对靶基因进行特定核酸编辑的技术。crispr/cas系统的工作原理是crrna(crispr-derived rna)通过碱基配对与tracrrna(trans-activating rna)结合形成tracrrna/crrna复合物，此复合物引导核酸酶如cas9蛋白至与crrna配对的靶序列位点处剪切双链dna，从而实现对基因组dna序列进行编辑；而通过人工设计这两种rna，可以改造形成具有引导作用的sgrna(single guiderna)，足以引导cas9对dna的定点切割。因此crispr/cas系统不仅可以应用于基因编辑，而且已经成为核酸检测的一种工具，显示了下一代分子诊断方法的巨大潜力。

2、相比较于传统病原体的鉴定方法，核酸检测技术是早期诊断的利器。尽管qpcr作为核酸检测金标准已经广泛应用于一线检测中，但是基于变温扩增的检测技术需昂贵的设备，且需要标准化的实验室和专业技术人员进行操作，反应时间长，难以满足即时检测要求，对于病原体含量极低的情况无法实现早期监测。如何更加快速、简便、准确、低成本的检测，是病原体核酸检测未来的发展方向。现有的一些核酸快速检测方法有lamp(环介导等温扩增)以及rpa-exo探针法(重组酶聚合酶扩增-探针法)等。这类方法在一些特殊恒温核酸扩增酶介导下，摆脱了对变温设备的依赖，靶标核酸可以在固定温度进行核酸扩增与检测。基于lamp或raa的核酸恒温扩增检测，虽然摆脱了热循环设备的限制，但是其高速扩增和高灵敏度带来了假阳性的可能。基于crispr/cas系统的恒温检测则在恒温扩增方法的基础上引入了高度精确的crispr系统，极大提高了检测方法的精确度与灵敏度。

3、当前，基于crispr的恒温速检测技术主要分为两大类，即2020年诺贝尔化学奖得主jennifer doudna开发的依赖于cas12a的称为detectr的核酸恒温检测技术，以及张锋开发的依赖于cas13a的称为sherlock的核酸恒温检测技术。其原理都是通过恒温扩增方法如lamp、rpa等对目的片段进行扩增富集，扩增后的目的片段会被cas蛋白通过一段sgrna的引导靶向识别，激活cas蛋白成为一个dna切割机(cas12a)或者rna切割机(cas13a)，将附近所有的单链dna(cas12a)或者单链rna(cas13a)进行切割。基于该原理，将单链dna制备成荧光淬灭探针，通过监测荧光信号的释放实现对目的序列的特异性检测。然而，使用单一的crispr/cas核酸检测的灵敏度非常有限，通常将核酸扩增技术与该检测技术联合应用，可大幅度提高检测的灵敏度。

4、因此，现有技术尚不存在用于常见呼吸道感染病毒检测的生物标记物及试剂盒，从而使得现有病原体早期监测防控技术存在一定的缺陷和不足。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的病原体早期监测防控技术的缺陷和不足问题，本发明提供了如下技术方案，提供用于常见呼吸道感染病毒检测的生物标记物及试剂盒，同时提供一种高灵敏度、高特异性、一管化、可视化、操作方法简单、快速、精准检测多重呼吸道感染病毒的方法，基于crispr/cas系统，结合rpa恒温扩增与crispr/cas荧光检测方法，建立一种可以联合检测5种常见呼吸道感染病毒及其不同亚型或不同靶标(甲型流感病毒h1n1型ha靶标、甲型流感病毒h3n2型ha靶标、乙型流感病毒ha靶标、乙型流感病毒ns1靶标、呼吸道合胞病毒a型、呼吸道合胞病毒b型、新型冠状病毒orf1ab靶标、人鼻病毒poly靶标)的高灵敏、高特异的可视化核酸检测方法。本发明建立的检测方法能够运用于公共卫生检测监控一线，无需昂贵仪器设备和专业标准实验室，对常见呼吸道感染病毒的早期监测诊断与防控具有重要意义。

2、本发明的第一方面在于提供一种用于常见呼吸道感染病毒及其不同亚型或不同靶标检测的生物标记物，所述生物标记物包括如表1所示的rpa引物和探针序列；所述常见呼吸道感染病毒为5种常见呼吸道感染病毒及其不同亚型或不同靶标，所述不同亚型或不同靶标包括甲型流感病毒h1n1型ha靶标、甲型流感病毒h3n2型ha靶标、乙型流感病毒ha靶标、乙型流感病毒ns1靶标、呼吸道合胞病毒a型、呼吸道合胞病毒b型、新型冠状病毒orf1ab靶标或人鼻病毒poly靶标；

3、表1

4、

5、

6、本发明的第二方面在于提供一种检测效果最理想、灵敏度、精准度最高的用于常见呼吸道感染病毒及其不同亚型或不同靶标检测的生物标记物，所述生物标记物包括如表2所示的qpcr引物和探针序列；所述常见呼吸道感染病毒为5种常见呼吸道感染病毒及其不同亚型或不同靶标，所述不同亚型或不同靶标包括甲型流感病毒h1n1型ha靶标、甲型流感病毒h3n2型ha靶标、乙型流感病毒ha靶标、乙型流感病毒ns1靶标、呼吸道合胞病毒a型、呼吸道合胞病毒b型、新型冠状病毒orf1ab靶标或人鼻病毒poly靶标；

7、表2

8、 引物名称 序列(5‘—3’) h1n1-ha-f ctcgtgctatggggcattca h1n1-ha-r tcgatccctcactttgggtc h3n2-ha-f gcaacagggatgcgaaatgt h3n2-ha-r ctgcttgtcctgttccctca flub-ha-f gggaacggcttcttcaacac flub-ha-r cagagtggaacccccaaaca flub-ns1-f agtgttggtgaacggaacct flub-ns1-r agcaacaagccctccattct rsv-a-f acgaaggctccacatacacag rsv-a-r gctggcatggatgattggaac rsv-b-f accaccacttcacatcagacat rsv-b-r ctgatcttgcatcctgtggaac cov2-orf1ab-f tgtgcaccactcactgtctt cov2-orf1ab-r tgggacctacagatggttgt rv-poly-f tgcggctaacctaaaccctg rv-poly-r aggaaacacggacacccaaa

9、。

10、本发明的第三方面在于提供一种检测效果最理想、灵敏度、精准度最高的用于常见呼吸道感染病毒及其不同亚型或不同靶标检测的生物标记物，所述生物标记物包括如表3所示的sgrna引物和探针序列；所述常见呼吸道感染病毒为5种常见呼吸道感染病毒及其不同亚型或不同靶标，所述不同亚型或不同靶标包括甲型流感病毒h1n1型ha靶标、甲型流感病毒h3n2型ha靶标、乙型流感病毒ha靶标、乙型流感病毒ns1靶标、呼吸道合胞病毒a型、呼吸道合胞病毒b型、新型冠状病毒orf1ab靶标或人鼻病毒poly靶标；

11、表3

12、

13、本发明的第四方面提供包含第一方面或第二方面或第三方面所述引物和/或所述探针的检测试剂或检测试剂盒。

14、本发明的第五方面提供一种用于常见呼吸道感染病毒监测的诊断试剂盒，包括和如第四方面所述的检测试剂盒。

15、本发明的第六方面用于提供与所述测试试剂盒配套的联合检测常见呼吸道感染病毒的rpa扩增反应系统，包括：

16、rpa引物的筛选，包括：对于每种靶标分别设计与合成多对rpa引物，通过在37℃扩增30分钟，对扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳后紫外观察；对每种靶标分别选择不同引物序列，并确定选择最多的引物序列为rpa反应的引物；

17、建立rpa扩增反应体系，包括：将一定量的第一缓冲液、上游引物序列、下游引物序列、第二缓冲液和阳性标准质粒进行混合后，采用无酶水补齐到第一总定量，混合均匀后加入装有干粉的检测单元管中，上下颠倒充分混匀并采用低速离心第一时间，在37℃反应第二时间，对扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳后进行紫外观察。

18、本发明的第七方面提供联合检测常见呼吸道感染病毒的crispr/cas12a系统。

19、目前已鉴定出很多种cas蛋白能在sgrna引导下对靶位点进行切割。cas12a属于该家族中的一种，能在sgrna引导下对靶基因进行特定切割，同时被激活的cas12a可发挥非特异性剪切酶活性，对所遇到的单链dna(ssdna)进行非特异性剪切。利用cas12a可被靶向激活的特性，经过特异性地设计，可以用于靶基因的特异性检测。

20、所述联合检测常见呼吸道感染病毒的crispr/cas12a系统包括：将一定量的cas12a、sgrna、ssdna探针、第三缓冲液以及靶序列进行混合后，用无酶水补齐到第二总定量，充分混匀后放到pcr仪或金属浴中37℃加热第三时间，然后在蓝光灯下通过肉眼观察或拍照记录终点荧光强度；或置于实时荧光定量pcr仪中按照37℃，每1分钟记录一次，60个循环，以实时记录荧光强度的变化。

21、本发明的第八方面提供一种基于一管化crispr/cas12a联合检测常见呼吸道感染病毒的方法，包括以下步骤：

22、a)采集受试者的随机体液样本；

23、b)基于所述受试者的随机体液样本和一管化rpa-crispr/cas12a联合检测常见呼吸道感染病毒，包括：将第六方面的10μlrpa扩增反应体系加在反应管管底，同时将第七方面的30μl crispr/cas12a反应体系加于反应管管盖上，先在37℃反应30分钟使得靶序列充分扩增，然后将反应管离心20s，使管盖上的crispr/cas12a反应体系与rpa产物混合，然后于37℃反应60分钟，使cas12a酶识别和切割靶序列，并切割体系中的ssdna以产生荧光；在蓝光灯下通过肉眼观察或拍照记录终点荧光强度，或在实时荧光定量pcr仪中实时记录荧光强度的变化。

24、本发明的有益效果：

25、能够用于即时检测(point-of-care testing,poct)5种常见呼吸道感染病毒的一管化rpa-crispr/cas12a检测用序列组合物、检测试剂盒和检测方法，通过将rpa的扩增方法与crispr/cas12的检测方法结合，设计了一种一管化rpa-crispr/cas12a的分子检测试剂盒和检测方法。该分子检测方法具有良好的特异性、敏感性，操作简便，成本低廉，不需要大型仪器设备，具有可视化的优势，更低的气溶胶污染风险，更有利于对常见呼吸道感染病毒的分子检测技术在poct中的推广和应用。