月季RcMYB35基因及其应用

本发明涉及植物基因工程，具体涉及一种月季rcmyb35基因及其应用。

背景技术：

1、全球气候变暖背景下，干旱和高温是限制植物生长发育的两大胁迫因素，其影响植物体内正常的生理活动。干旱和高温胁迫之间具有相关性，常以同时出现或者相继发生的形式出现，在一定程度上影响植物地理分布，降低物种多样性。干旱导致植物缺乏水分，通过影响光合作用、呼吸作用、生理代谢、激素积累、膜损伤等过程，导致植物生长发育受阻、成活率降低(张俊杰等，2023；董蕾和李吉跃，2013；杨倩等，2017；陈兰等，2022)。高温形成的热害可以直接影响植物的生长发育及各种代谢活动，尤其是引起植物细胞代谢和信号功能紊乱，生殖器官的代谢受阻、花粉不育等现象(richter et al.2010；hedhly etal.2011；bahuguna et al.2015；vu et al.2019)。

2、植物中myb转录因子首次在玉米中发现并克隆(paz-ares et al.1987)，后期研究人员通过现代分子生物学手段不断探究myb转录因子在植物抗逆中的功能及作用机制。植物受到干旱胁迫后，myb转录因子通过多种途径参与植物对干旱胁迫的响应。如通过增加细胞内自由脯氨酸的积累，提高抗氧化酶类的含量与活性，或调控类黄酮类物质、蜡质、角质等生物合成，或通过aba信号参与气孔运动等多种途径来调控植物耐旱性(wang etal.2016；lee et al.2014；oh et al.2011)。植物受到高温胁迫后，myb转录因子通过直接激活谷氨酸代谢相关基因，或调节钙信号通路参与氧化和热应激反应等方式影响植物对高温的抗性能力，此外还可以通过苯丙氨酸代谢、激素信号传导等协调植物抗性，上述在拟南芥、水稻、苹果、菊花等有相关报道(zhou et al.2021，hao et al.2021)。

3、月季作为世界四大鲜切花之一，具有极高的观赏和经济价值。改良月季的抗性及培育高抗新优品种一直是月季育种的重点之一。本发明涉及的rcmyb35是月季myb家族成员之一，该基因受到高温和干旱的诱导，在烟草中超量表达该基因，使转基因植株的干旱和高温耐受性降低，而沉默月季中的该基因表现出对干旱和高温胁迫的抗性增强。因此，分离并鉴定rcmyb35基因在月季抗逆性方面的生物学功能，对今后通过基因编辑技术改良植物耐旱性和耐热性具有重要的实践意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种月季rcmyb35基因及其应用；该应用是rcmyb35基因的核苷酸编码序列的克隆；表达载体的构建，将rcmyb35基因的完整翻译区与花椰菜花叶病毒启动子结合后转入植物体(宿主烟草)内，得到rcmyb35超量表达植株；干涉载体的构建，将rcmyb35基因的部分片段整合到ptrv2沉默载体中，通过瞬时转化月季花瓣，得到rcmyb35基因沉默花瓣；对转基因烟草和基因沉默月季花瓣进行分子鉴定和表型观察，以评估该基因在调节植物耐旱性和耐热性中的应用前景。

2、转基因烟草在干旱和高温条件下耐旱性和耐热性降低，而该基因沉默的月季花瓣耐脱水能力和耐热能力提高。本发明为今后通过基因编辑技术敲除月季及其近缘种中该基因以增强植株的耐旱性和耐热性具有重要的参考意义。

3、为实现上述目的，本发明所设计的技术方案如：

4、本发明提供了一种月季rcmyb35基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、本发明还提供了一种上述转录因子编码的蛋白rcmyb35，其氨基酸序列为seq idno.2所示。

6、本发明还提供了一种用于获得上述的rcmyb35转录因子的引物对，所述引物对为：

7、rcmyb35正向引物：5’-ggggtaccatgggaaggccaccttgctgt-3’，rcmyb35反向引物：5’-cgggatccttagtaatcaaaacatccatcca-3’。

8、获得上述rcmyb35基因的方法如下：

9、以月季‘月月粉’叶片cdna为模板和上述rcmyb35基因的引物对，进行pcr扩增，纯化得到rcmyb35基因；其中，

10、pcr体系：

11、

12、pcr的条件：

13、

14、本发明还提供了一种用于获得上述rcmyb35基因的沉默载体构建引物对，所述引物对为：

15、rcmyb35i正向引物：5’-gctctagacttcccttcggctttctgt-3’，

16、rcmyb35i反向引物：5’-ggggtaccaatgctgccctcatctcac-3’；

17、获得rcmyb35基因沉默区域片段的方法如下：

18、以上述获得rcmyb35基因片段为模板和上述rcmyb35i基因的引物对，进行pcr扩增，纯化得到rcmyb35i基因沉默区域片段；其pcr扩增方法和体系同上述方法和体系。

19、本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述rcmyb35基因的植物表达载体，其中所述植物表达载体为pcambia2300s。

20、上述重组表达载体的构建方法，包括以下步骤：

21、将目的片段导入克隆载体18t中，然后进行将含目的基因的克隆载体18t和pcambia2300s用kpnⅰ和bamhⅰ双酶切进行酶切，再将得到的目的片段连接到酶切过的pcambia2300s载体上即得到重组表达载体pcambia2300s-rcmyb35。

22、本发明还提供了一种重组沉默载体，所述重组沉默载体含有上述rcmyb35基因的植物沉默载体，其中所述植物表达载体为ptrv2。

23、上述重组沉默载体的构建方法，包括以下步骤：

24、将基因沉默片段rcmyb35i导入克隆载体18t中，然后分别将含基因沉默片段的克隆载体18t和ptrv2用xbaⅰ和kpnⅰ进行酶切，再将得到的目的片段rcmyb35i连接到酶切过的ptrv2载体上即得到重组沉默载体ptrv2-rcmyb35i。

25、本发明还提供了一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞为农杆菌gv3101，且所述宿主细胞内含有上述重组表达载体或上述重组沉默载体。

26、下述各项之一在调控植物耐旱性中的应用，它包括：

27、(1)上述的rcmyb35基因；

28、(2)上述的重组表达载体

29、(3)上述的重组沉默载体；

30、(4)上述的宿主细胞。

31、作为优选方案，所述植物为烟草或月季。

32、下述各项之一在培育耐旱性的新植物品种中的应用，它包括：

33、(1)上述的rcmyb35基因；

34、(2)上述的重组表达载体

35、(3)上述的重组沉默载体；

36、(4)上述的宿主细胞。

37、本发明的有益效果：

38、本发明基因命名为rcmyb35，其通过构建超量表达载体pcambia2300s-rcmyb35导入到烟草中，得到转基因烟草。转基因烟草相较于对照烟草耐旱性和耐热性降低。通过构建沉默载体ptrv2-rcmyb35i导入到月季花瓣中，得到月季基因沉默花瓣相较于对照花瓣耐脱水胁迫能力和耐热性提高。rcmyb35基因为我们通过植物基因编辑技术调控植物的耐旱能力提供了分子生物学基础。该基因的应用将有助于增强植株的耐旱性和耐热性，改善植物品质，培育性状优良新品种。

39、综上所述：本发明可以通过基因编辑技术增强植物的耐旱性和耐热性，减轻植物的受伤害程度，提高植物的品质和观赏性。