小麦条锈菌SNP分子标记、KASP检测引物组及应用

本发明涉及snp分子标记以及检测引物，尤其涉及小麦条锈菌snp分子标记、kasp检测引物组及其在小麦条锈菌遗传多样性分析中的应用，属于小麦条锈菌snp分子标记及其应用领域。

背景技术：

1、小麦条锈菌（ puccinia striiformisf.sp . tritici）是一种全世界范围内的气传性真菌病害。小麦条锈菌一般侵染小麦叶片、叶鞘、茎秆及穗部。一方面，病原菌寄生吸食小麦体内营养物质，破坏叶绿素，导致光合作用减弱及破坏正常生理机能；另一方面，小麦叶片表皮遭到破坏，蒸腾作用显著增加，缺失水分导致灌浆不良。感病小麦籽粒干瘪，产量下降，蛋白质含量降低，品质变劣，同时因植株孱弱而易受低温冻害和干旱影响。因此有必要开发适宜的分子标记，对小麦条锈菌群体遗传结构及遗传分化进行系统研究，了解小麦条锈菌遗传变异与环境变化之间的演化规律，为合理防控小麦条锈菌病害提供理论依据。

2、单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，snp）技术着眼于单个位点上不同的等位基因，基于核苷酸之间的区别，实现对单一核苷酸完成分子层面研究，适合高通量检测（brookes 1999），其发展推广与 dna 芯片的联系密不可分。snp分子标记具有分布广泛，多态性高，遗传稳定性高等优点，被广泛应用于种质资源遗传多样性分析、目标性状基因的标记与定位、抗性育种、作物品种纯度鉴定及品质鉴定等方面。

3、竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应 (kompetitive allele specific pcr，kasp) 是一种基于单核苷酸多态性 (snp) 的新型基因分型技术，可从基因组水平对snp和插入缺失多态性 (indel) 进行精准分型，该技术原理是依据引物末端碱基特异性配对，利用沉降式pcr进行扩增与荧光淬灭探针相结合，检测发出的荧光信号类型进行基因分型。

4、目前，基于kasp技术开发小麦条锈菌snp分子标记的研究相对较少，且现有的kasp-snp引物分型效果差，应用于小麦条锈菌遗传结构的研究存在较多的缺陷。

技术实现思路

1、为此，本发明根据国内外小麦条锈菌全基因组比较，筛选出12个分布均匀，多态性高的snp位点，并将12个位点都转化为了kasp标记。

2、目前基于kasp技术开发小麦条锈菌snp分子标记的报道相对较少，本发明用生物信息学的方法，开发了具有多态性的小麦条锈菌kasp-snp分子标记，为小麦条锈菌群体遗传结构及遗传分化研究提供有效的工具。

3、为实现上述目的，本发明所主要采取的技术方案包括：

4、本发明首先提供了基于kasp技术开发的小麦条锈菌snp分子标记，所述分子标记由以下（1）-（12）所述的12个snp位点组成：

5、（1）snp位点1的等位变异碱基为c/t，其位于小麦条锈菌基因组序列supercont.3的第442202位；

6、（2）snp位点2的等位变异碱基为c/t，其位于小麦条锈菌基因组序列supercont.1的第298417位；

7、（3）snp位点3的等位变异碱基为c/t，其位于小麦条锈菌基因组序列supercont.16的第108630位；

8、（4）snp位点4的等位变异碱基为c/t，其位于小麦条锈菌基因组序列supercont.23的第73782位；

9、（5）snp位点5的等位变异碱基为c/g，其位于小麦条锈菌基因组序列supercont.109的第152246位；

10、（6）snp位点6的等位变异碱基为c/t，其位于小麦条锈菌基因组序列supercont.116的第239091位；

11、（7）snp位点7标记的等位变异碱基为a/g，其位于小麦条锈菌基因组序列supercont.117的第206340位；

12、（8）snp位点8的等位变异碱基为c/t，其位于小麦条锈菌基因组序列supercont.113的第62255位；

13、（9）snp位点9的等位变异碱基为c/t，其位于小麦条锈菌基因组序列supercont.120的第53959位；

14、（10）snp位点10的等位变异碱基为c/t，其位于小麦条锈菌基因组序列supercont.136的第207251位；

15、（11）snp位点11的等位变异碱基为a/g，其位于小麦条锈菌基因组序列supercont.24的第180282位；

16、（12）snp位点12的等位变异碱基为a/t，其位于小麦条锈菌基因组序列supercont.15的第804248位；

17、本发明的另一方面是提供了用于扩增上述小麦条锈菌snp分子标记的kasp引物组，所述kasp引物组由以下（1）-（12）所述的12个kasp引物组组成，其中，每个kasp引物组合由两条3'末端碱基不同的正向引物f1和f2及一条反向引物r构成；

18、（1）kasp引物组合1：该kasp引物组合1用于扩增snp位点1，由核苷酸序列为seq idno.1所示的正向引物f1、核苷酸序列为seq id no.2所示的正向引物f2以及核苷酸序列为seq id no.3所示的反向引物r组成；

19、（2）kasp引物组合2：该kasp引物组合2用于扩增snp位点2，由核苷酸序列为seq idno.4所示的正向引物f1、核苷酸序列为seq id no.5所示的正向引物f2以及核苷酸序列为seq id no.6所示的反向引物r组成；

20、（3）kasp引物组合3：该kasp引物组合3用于扩增snp位点3，由核苷酸序列为seq idno.7所示的正向引物f1、核苷酸序列为seq id no.8所示的正向引物f2以及核苷酸序列为seq id no.9所示的反向引物r组成；

21、（4）kasp引物组合4：该kasp引物组合4用于扩增snp位点4，由核苷酸序列为seq idno.10所示的正向引物f1、核苷酸序列为seq id no.11所示的正向引物f2以及核苷酸序列为seq id no.12所示的反向引物r组成；

22、（5）kasp引物组合5：该kasp引物组合5用于扩增snp位点5，由核苷酸序列为seq idno.13所示的正向引物f1、核苷酸序列为seq id no.14所示的正向引物f2以及核苷酸序列为seq id no.15所示的反向引物r组成；

23、（6）kasp引物组合6：该kasp引物组合6用于扩增snp位点6，由核苷酸序列为seq idno.16所示的正向引物f1、核苷酸序列为seq id no.17所示的正向引物f2以及核苷酸序列为seq id no.18所示的反向引物r组成；

24、（7）kasp引物组合7：该kasp引物组合7用于扩增snp位点7，由核苷酸序列为seq idno.19所示的正向引物f1、核苷酸序列为seq id no.20所示的正向引物f2以及核苷酸序列为seq id no.21所示的反向引物r组成；

25、（8）kasp引物组合8：该kasp引物组合8用于扩增snp位点8，由核苷酸序列为seq idno.22所示的正向引物f1、核苷酸序列为seq id no.23所示的正向引物f2以及核苷酸序列为seq id no.24所示的反向引物r组成；

26、（9）kasp引物组合9：该kasp引物组合9用于扩增snp位点9，由核苷酸序列为seq idno.25所示的正向引物f1、核苷酸序列为seq id no.26所示的正向引物f2以及核苷酸序列为seq id no.27所示的反向引物r组成；

27、（10）kasp引物组合10：该kasp引物组合10用于扩增snp位点10，由核苷酸序列为seq id no.28所示的正向引物f1、核苷酸序列为seq id no.29所示的正向引物f2以及核苷酸序列为seq id no.30所示的反向引物r组成；

28、（11）kasp引物组合11：该kasp引物组合11用于扩增snp位点11，由核苷酸序列为seq id no.31所示的正向引物f1、核苷酸序列为seq id no.32所示的正向引物f2以及核苷酸序列为seq id no.33所示的反向引物r组成；

29、（12）kasp引物组合12：该kasp引物组合12用于扩增snp位点12，由核苷酸序列为seq id no.34所示的正向引物f1、核苷酸序列为seq id no.35所示的正向引物f2以及核苷酸序列为seq id no.36所示的反向引物r组成。

30、本发明的优选的具体实施方案，所述正向引物f1和f2的5'-端分别连接着fam-tail（5'-gaaggtgaccaagttcatgct-3'）通用荧光标签序列和hex-tail（5'-gaaggtcggagtcaacggatt-3）通用荧光标签序列。

31、本发明的再一方面是将所述的小麦条锈菌snp分子标记或检测小麦条锈菌snp分子标记的kasp引物组应用于小麦条锈菌遗传多样性的分析；包括：

32、(1)对小麦条锈菌进行采集、分离、鉴定；

33、(2)提取小麦条锈菌基因组dna；

34、(3)对步骤（2）得到的基因组dna为模板、以检测小麦条锈菌snp分子标记的kasp引物组为检测引物建立pcr反应体系进行pcr扩增得到pcr扩增产物；

35、(4)将步骤（3）得到的pcr扩增产物进行荧光信号值的读取获取kasp-snp 分型数据；

36、(5)根据所获取的kasp-snp 分型数据对小麦条锈菌遗传多样性进行分析。

37、本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（3）中的pcr反应体系：2×kasp mix 170ul；上游引物f1 0.51 ul，上游引物f2 0.51 ul，下游引物1.36 ul；dna(100ng/ul)1 ul；总反应体系为172.38 ul(96个样品量)；所述的pcr扩增的程序为：95℃预变性10 min；95℃变性20 s，61℃(-0.6℃/循环)退火45 s，10个循环；95℃变性20 s，55℃退火45 s，35个循环。

38、本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（5）中根据所获取的kasp-snp 分型数据进行转化生成二元基因型数据矩阵后对小麦条锈菌遗传多样性进行分析，其中，所获取的kasp-snp分型数据进行转化的方法包括：将“xx”转化为“10”，“xy”转化为“11”，“yy”转化为“01”；

39、本发明的一种优选的具体实施方案，步骤（5）中根据所获取的kasp-snp 分型数据对小麦条锈菌遗传多样性进行分析的方法选自以下（a）-(e)中的任何一种或多种：

40、(a) 计算小麦条锈菌遗传多样性水平的参数：通过excel中的 genalex 6.5 插件完成等位基因数、杂合度以及香农信息指数的计算；

41、(b) 分析小麦条锈菌的遗传结构：通过 structure 2.3 软件实现，参数 k 的范围为 2~10，经过 15 次重复运算后由 structure harvester 在线显示其最佳数值，运用clumpp 1.1.2实现重复抽样检验，最终成像则通过 distruct 1.1完成；

42、(c) 构建小麦条锈菌的遗传聚类图：聚类运算基于 upgma方法，利用powermarker 3.25 软件完成并通过 mege软件进行图形化，itol在线软件进行图形美化；

43、(d)构建二维主坐标分析图并用于完成对小麦条锈菌群体内部及相互之间遗传变异起评估作用的分子方差分析：采用excel中的genalex 6.5 插件计算群体内部及相互之间遗传变异起评估作用的分子方差分析（analysis of molecular genetic variance，amova）；

44、(e) 计算小麦条锈菌不同地区群体之间的成对遗传分化以及计算小麦条锈菌群体间基因流：采用excel中的genalex 6.5 插件计算小麦条锈菌不同地区群体之间的成对遗传分化（fst），进一步依据公式 nm= 0.25（1 - fst）/fst 计算小麦条锈菌群体间基因流。

45、本发明的再一方面是提供了一种检测小麦条锈菌的kasp检测试剂盒，包括kaspmix和kasp检测引物组；其中，所述的kasp检测引物组由上述的kasp引物组合1- kasp引物组合12组成。

46、本发明基于kasp基于开发小麦条锈菌snp分子标记，获得了不同于现有技术的具有高多态性、分型效果好、重复性好的snp分子标记，能够应用于快速有效的分析小麦条锈菌群体遗传结构。

47、本发明涉及缩略语和关键术语定义

48、snp：单核苷酸多态性。

49、kasp：竞争性等位基因特异性pcr。