一种鉴定广东万山群岛斜带石斑鱼原生种的SSR分子标记及其引物组和应用

本发明属于分子生物，具体涉及一种鉴定广东万山群岛斜带石斑鱼原生种的ssr分子标记及其引物组和应用。

背景技术：

1、斜带石斑鱼(epinephelus coioides)，俗名“青斑”，隶属鲈形目(perciformes)、鮨科(serranidae)、石斑鱼属(epinephelus)。斜带石斑鱼属暖水性岛礁海水鱼，主要分布西至红海，南至南非，东至帕劳群岛和斐济群岛，北至琉球群岛，在我国广东、海南、福建等地皆有分布。常栖息于大陆沿岸和大岛屿，但在河口、离岸100米深的水域中也有发现。斜带石斑鱼是我国南方重要的养殖鱼类，由于其肉质鲜美、营养丰富、抗逆性强、生长快、体色艳丽，市场价格高且稳定，受到消费者和养殖者的青睐。

2、万山群岛位于珠江口正南方，地理范围包括：东起九龙半岛南端与担杆岛的担杆头连线以西，西至崖门口西岸与大襟岛西岸连线以东；北自虎门，南到大襟岛南的三杯酒岛范围内的所有岛屿。散布面积2600平方公里，岛屿总面积80.582平方公里。万山群岛是全国第二大天然渔场，海产丰富。斜带石斑鱼是万山群岛其中一种主要的特色经济鱼类。但随着环境变化和人类捕捞、航行、旅游等活动增加，该海域斜带石斑鱼资源急剧下降。

3、通过将人工增殖培育的斜带石斑鱼幼苗投放到万山群岛海域，是一种对天然种群恢复或增加的有效方法。然而，来自不同海域的斜带石斑鱼在口味、品相和环境适应性等各方面都会有差别，将来自其他海区亲本所培育的斜带石斑鱼投放到万山群岛海域，会对该海域种质资源造成污染。通过肉眼非常难判断斜带石斑鱼亲本的原生地。因此，需要建立一种可靠的分子生物学技术，用于鉴定广东万山群岛的斜带石斑鱼原生种。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种鉴定广东万山群岛斜带石斑鱼原生种的ssr分子标记及其引物组和应用，解决现有斜带石斑鱼地理种群鉴别不清晰，在增殖放流种苗的原生种亲本难于判别的问题。

2、本发明的第一个目的是提供一种鉴定广东万山群岛斜带石斑鱼原生种的ssr分子标记，所述的分子标记包括分子标记ecws-01、ecws-02、ecws-03、ecws-04、ecws-05、ecws-06，所述的分子标记ecws-01、ecws-02、ecws-03、ecws-04、ecws-05、ecws-06的核苷酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6所示。

3、本发明的第二个目的是提供一种鉴定广东万山群岛斜带石斑鱼原生种的引物组，其包括针对分子标记ecws-01、ecws-02、ecws-03、ecws-04、ecws-05、ecws-06的引物对；

4、所述的ecws-01、ecws-02、ecws-03、ecws-04、ecws-05、ecws-06的引物对分别如下：

5、针对ecws-01：

6、ecws-01-f：5’-tgtgaagcgaccttgggttt-3’；

7、ecws-01-r：5’-aatgctaccacacgagccaa-3’；

8、针对ecws-02：

9、ecws-02-f：5’-gcggatagcctctgggtttt-3’；

10、ecws-02-r：5’-gcgccaccatcaggactatt-3’；

11、针对ecws-03：

12、ecws-03-f：5’-ccagagcctgtgaggttcag-3’；

13、ecws-03-r：5’-gatcgtggccacctgatagg-3’；

14、针对ecws-04：

15、ecws-04-f：5’-catcggactctgcctgtctc-3’；

16、ecws-04-r：5’-gcaggagttggctcatccat-3’；

17、针对ecws-05：

18、ecws-05-f：5’-aacccctgcagtgatgtctg-3’；

19、ecws-05-r：5’-ttgctgtacgctgttccact-3’；

20、针对ecws-06：

21、ecws-06-f：5’-gctgatgcctggaggtcttt-3’；

22、ecws-06-r：5’-ttgacacagcgtcccagatc-3’。

23、本发明的第三个目的是提供所述ssr分子标记或所述引物组在鉴定广东万山群岛斜带石斑鱼原生种、鉴别增殖放流种苗的广东万山群岛斜带石斑鱼原生种亲本中的应用。

24、本发明的第四个目的是提供一种鉴定广东万山群岛斜带石斑鱼原生的检测试剂盒，其含有上述引物组。

25、本发明第五个目的是提供一种鉴定广东万山群岛斜带石斑鱼原生种的方法，包括以下步骤：

26、s1.收集待鉴定斜带石斑鱼群体样本，提取样本dna；

27、s2.以步骤s1提取的dna为模板，分别利用上述引物组进行pcr扩增；

28、s3.对步骤s2扩增后的pcr产物进行毛细管电泳分型；

29、s4.对步骤s3获得的分型结果进行峰图判读和构建等位基因矩阵；

30、s5.通过步骤s4得到的待检测斜带石斑鱼等位基因，并与已知广东万山群岛斜带石斑鱼原生种的等位基因进行比较，计算样品之间的遗传距离；

31、s6.对步骤s5得到的遗传距离，进行聚类分析，构建聚类树，并通过聚类树判断待检测斜带石斑鱼是否为万山群岛原生种。

32、优选地，步骤s2中pcr扩增的反应体系包括：不含mg2+的10×pcrbuffer 2.5l、25mmmgcl22.0 l、10mm dntp 0.5l、高保真pcr酶1u、10m正向引物0.5l、10m反向引物0.5l、dna模板12.5ng，其余由无菌双蒸水补足至25l。

33、优选地，步骤s2中pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；72℃再延伸6分钟。

34、优选地，步骤s3中毛细管电泳分型将ssr标记引物的5’端标记fam荧光基团，并利用abi 3730xl基因型分型测序仪进行毛细管电泳分型。

35、优选地，步骤s5中广东万山群岛斜带石斑鱼原生种的等位基因包括：

36、ecws-01位点为：229、280；

37、ecws-02位点为：267、276；

38、ecws-03位点为：209、216、232；

39、ecws-04位点为：214、235；

40、ecws-05位点为：252、260；

41、ecws-06位点为：302、341、348。

42、本发明通过对斜带石斑鱼基因组(递交号为prjeb28248，总长为1023.56mb，gc含量41.3％，scaffoldn50长度2.44mb，contign50长度2.33mb。)进行设计得到ssr分子标记，ssr分子标记为ecws-01、ecws-02、ecws-03、ecws-04、ecws-05、ecws-06，其核苷酸序列分别如seq id no.1～6所示。通过对上述ssr分子标记进行验证，表明本发明提供的6个ssr位点具有多态性高，但在广东万山群岛原生群体中多态性低且高度保守的特点；同时，筛选得到能用于扩增上述ssr分子标记的引物组。

43、本发明研究表明，采用上述引物组能够鉴定广东万山群岛海域斜带石斑鱼原生种，该引物扩增稳定、重复性好；同时建立能鉴定广东万山群岛斜带石斑鱼原生种的方法，能够通过广东万山群岛斜带石斑鱼原生种的特有等位基因，以及进行upgma聚类分析，构建聚类树，能直接鉴别斜带石斑鱼地理种群是否属于广东万山群岛斜带石斑鱼原生种。

44、本发明具有以下有益效果：

45、本发明设计得到一种鉴定广东万山群岛斜带石斑鱼原生种的ssr分子标记，即ssr分子标记ecws-01、ecws-02、ecws-03、ecws-04、ecws-05、ecws-06，其核苷酸序列分别如seqid no.1～6所示，该ssr分子标记具有多态性高，但在广东万山群岛原生群体中多态性低且高度保守的特点；可以有效区分广东万山群岛海域斜带石斑鱼原生群体与其他群体。还筛选得到能用于扩增上述ssr分子标记的引物组，该引物扩增稳定、重复性好；同时建立了能鉴定广东万山群岛斜带石斑鱼原生种的方法，通过特有等位基因和聚类树判断待鉴定斜带石斑鱼是否为原生种，解决现有斜带石斑鱼地理种群鉴别不清晰，在增殖放流种苗的原生种亲本难于判别的问题。