用于识别并结合人结直肠癌细胞的RNA核酸适体及其应用

本发明涉及生物，具体涉及一种用于识别并结合人结直肠癌细胞的rna核酸适体及其应用。

背景技术：

1、核酸适体(aptamer)是一种可以特异性地与靶标结合的单链核苷酸(dna或rna分子)，分子量小，易设计合成，可折叠形成特定构象特异性结合生物靶标，也因此被美誉为“化学抗体”。核酸适体具备合成简单、易修饰、化学性质稳定、免疫原性低、成本低廉等优点，可作为良好的发新型高效稳定的分子探针，在癌症的早期诊断和精准靶向治疗、药物治疗以及生物化学传感等领域极具前景。

2、靶标结合核酸适体的选择通常采用selex的方法，该方法允许我们从1013-1016个初始核酸分子中指数化富集结合的序列，并借由测序技术得到特定核酸适体的候选序列，然后通过表面等离子共振、等温量热滴定等技术手段测量候选适配体和靶标的结合。在过去的几十年里，为了得到性能更优良、更丰富的核酸适体，研究者在selex方法的改进上进行了大量的探索，提出了包括cell-selex、capture-selex、go-selex、gold-selex等selex新方法，这些方法客观上提高了筛选的效率，但重复选择结合pcr扩增的固有属性使得我们仍然面临着不可避免的伪影带来的指数富集相关的不确定性。这些伪影产生的原因很复杂，包括非核酸适体的不彻底分离、引物序列的影响以及pcr扩增、转录和逆转录过程中的序列偏好。

3、除了对selex方法的优化外，研究者们试图通过缩短选择的时间、简化适体选择的步骤的方式来规避selex过程的不利影响，即通过单轮选择的方式分离适配体，这些方法大多用于dna适体的获取。然而，这些方法并没有得到比selex方法更广泛的应用，原因是多种多样的，如相比于selex，单轮选择需要从大量的过量非适配体核酸中发现适配体，且现有的单轮选择方法难以保证得到的适配体具有较好的结合性能。此外，相对于rna适体，dna本身更稳定，且可以直接通过pcr扩增，每一轮筛选的过程并不复杂，即使是一位初学者也可以在一天之内完成一轮的适体选择。并且考虑到每次重复选择过程中pcr错误的积累客观上增加了序列的多样性，为核酸适配体结构的优化和更高亲和力的核酸适体的获取提供了更多的机会，dna适体的selex方法相比于其单轮选择可能在多数情况下是一种更优先的选择。

4、然而，rna适体的选择与dna适体的选择有着显著的区别，这体现在rna的不稳定性和不能直接作为pcr的模板进行扩增，这意味着在rna适体的选择中对筛选轮数的缩减可能是更有意义的。同时，基于rna核酸适体本身可以通过体内或体外转录大量制备的特点，基于rna的体内调控或体外规模化生产具有独特的价值，提高rna核酸适体的获取效率具有重要意义。现有的关于rna适体的单轮筛选方法的报道是鲜见的，这包括了使用人类基因组rna库作为初始文库的ht-seq研究和基于rnase消化和已知序列dna载体的rna适体单轮选择方法。然而，这些方法都存在着各自的局限性，目前我们仍然缺乏性能良好的rna适体，开发rna适体单轮筛选方法仍然是一项有意义的工作。

5、根据国际癌症研究中心(international agency for research on cancer,iarc)globocan项目的统计数据，2020年，结直肠癌是全球第三大常见的恶性肿瘤，也是恶性肿瘤相关死亡的第二大原因。大多数结直肠癌是由息肉引起，起始于异常的腺窝，后逐渐演变成息肉，最终发展为结肠直肠癌，整个过程可长达5-15年。结直肠癌发展到晚期之前，基本无明显症状表现，很多患者平时没症状，一查就已是中晚期。癌症的早筛早诊有利于提高结直肠癌患者的总体生存率，目前常见的筛查手段包括直肠指诊、粪便隐血试验、基因检测，以及结肠镜检查等。然而，目前，我国结直肠癌筛查的参与率并不理想，这可能与居民对筛查的重要性缺乏认识有关；也可能是因为现行的筛查手段，特别是具有侵入性的肠镜筛查很难被接受，尤其对于无症状的人群。此外，早发性结直肠癌似乎比晚发性结直肠癌具有更强的侵袭性表型，其在组织学上多为低分化型，更常见的是有黏液和印戒特征，这些特征也使得这类结直肠癌更难被“筛”查出来。因此，为了解决肠癌早期诊断困难的问题，筛选具有特异性识别肠癌细胞的核酸适体，发现肠癌标志物，对肿瘤的早期诊断及预后治疗具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于识别并结合人结直肠癌细胞的rna核酸适体及其应用。

2、第一方面，本发明要求保护一种成套核酸适体。

3、本发明所要求保护的成套核酸适体能够识别并结合人结直肠癌细胞，具体由如下五个核酸适体中的全部或部分组成：

4、(a1)核酸适体1：seq id no.1所示单链rna分子；

5、(a2)核酸适体2：seq id no.2所示单链rna分子；

6、(a3)核酸适体3：seq id no.3所示单链rna分子；

7、(a4)核酸适体4：seq id no.4所示单链rna分子；

8、(a5)核酸适体5：seq id no.5所示单链rna分子；

9、所述部分为2个或2个以上核酸适体。

10、在本发明的具体实施方式中，所述核酸适体1、所述核酸适体2、所述核酸适体3、所述核酸适体4和所述核酸适体5中c和u均经2′-氟代修饰。

11、第二方面，本发明要求保护一种成套核酸适体衍生物。

12、本发明所要求保护的成套核酸适体衍生物为对组成前文第一方面所述成套核酸适体中的各个单一核酸适体均进行如下操作后所得：对所述单一核酸适体的一端或中间(一个位置或者多个位置连接)接上荧光素和/或抗肿瘤药物和/或放射性元素和/或生物酶和/或生物素和/或纳米材料，得到与所述单一核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。在本发明的具体实施方式中，是在所述单一核酸适体的5’末端接上了异硫氰酸荧光素(fitc)。

13、第三方面，本发明要求保护一种核酸适体。

14、本发明所要求保护的核酸适体用于识别并结合人结直肠癌细胞，具体可为如下五个核酸适体中的任意一个：

15、(a1)核酸适体1：seq id no.1所示单链rna分子；

16、(a2)核酸适体2：seq id no.2所示单链rna分子；

17、(a3)核酸适体3：seq id no.3所示单链rna分子；

18、(a4)核酸适体4：seq id no.4所示单链rna分子；

19、(a5)核酸适体5：seq id no.5所示单链rna分子。

20、在本发明的具体实施方式中，所述核酸适体1、所述核酸适体2、所述核酸适体3、所述核酸适体4和所述核酸适体5中c和u均经2′-氟代修饰。

21、第四方面，本发明要求保护核酸适体衍生物。

22、本发明要求保护的核酸适体衍生物为对前文第三方面所述核酸适体的一端或中间接上化学基团和/或荧光素和/或抗肿瘤药物和/或放射性元素和/或生物酶和/或生物素和/或纳米材料，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。在本发明的具体实施方式中，是在所述核酸适体的5’末端接上了异硫氰酸荧光素(fitc)。

23、第五方面，本发明要求保护一种用于识别并结合肠癌细胞的检测试剂。

24、本发明所要求保护的用于识别并结合肠癌细胞的检测试剂，其有效成分为或包含前文第一方面所述的成套核酸适体或前文第二方面所述的成套核酸适体衍生物或前文第三方面所述的核酸适体或前文第四方面所述的核酸适体衍生物。

25、第六方面，本发明要求保护前文第一方面所述的成套核酸适体或前文第二方面所述的成套核酸适体衍生物或前文第三方面所述的核酸适体或前文第四方面所述的核酸适体衍生物在制备用于识别并结合肠癌细胞的产品中的应用或在识别并结合肠癌细胞中的应用。

26、第七方面，本发明要求保护前文第一方面所述的成套核酸适体或前文第二方面所述的成套核酸适体衍生物或前文第三方面所述的核酸适体或前文第四方面所述的核酸适体衍生物在如下任一中的应用：

27、(b1)制备用于识别并结合肠癌细胞的产品，或识别并结合肠癌细胞；

28、(b2)制备肠癌病理研究产品；

29、(b3)制备肠癌诊断产品；

30、(b4)制备肠癌治疗产品；

31、(b5)制备用于对肠癌细胞进行成像的产品，或对肠癌细胞进行成像。

32、在上述各相关方面中，所述肠癌细胞为结直肠细胞(如人结直肠细胞)；所述肠癌为结直肠癌(如人结直肠)。

33、在本发明的具体实施方式中，所述结直肠癌细胞为人结直肠癌细胞hct-8。

34、第八方面，本发明要求保护前文第一方面所述的成套核酸适体或前文第二方面所述的成套核酸适体衍生物在如下任一中的应用：

35、(c1)制备用于对正常细胞和不同来源肿瘤细胞进行分子分型的产品；

36、(c2)对正常细胞和不同来源肿瘤细胞进行分子分型。

37、在本发明的具体实施方式中，所述正常细胞可选自如下：hek-293t、sv-huc-1、c2c12、dc2.4。所述不同来源肿瘤细胞可选自：hct-8、mda-mb-231、tov21g、a549。

38、本发明以传统的cell-selex技术为基础，结合umi和高通量测序技术，设计了通过单轮/寡轮筛选快速获取rna适体的方法。本发明以人结直肠癌细胞株hct-8为靶标细胞，经过两轮的筛选后，构建umi测序文库并进行高通量测序，挑选出多条识别结直肠癌细胞的核酸适体。本发明筛选得到的核酸适体具备免疫原性低、易于修饰标记、性质稳定且重现性好的特点；相较于抗体，稳定性良好，合成成本低。后续可通过对核酸适体的性质进行进一步的表征和靶标的鉴定，有助于探索和发现肿瘤标志物。同时核酸适体可作为高效且穿透力强的分子探针工具用于肿瘤的早期诊断，也可结合药物进行肿瘤(结直肠癌)靶向治疗。