一种人细胞色素P4503A4酶活性的检测方法及其应用

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于检测人细胞色素p450 3a4(cytochrome p450 3a4,cyp3a4)酶活性的荧光检测方法及其应用。

背景技术：

1、细胞色素p450酶(cyps)是一类含血红素的单加氧酶，广泛分布于各种生物体中。值得注意的是，人类已发现的57种功能性cyp中，根据序列相似性分为18个家族和44个亚家族。在所有已鉴定的人类cyp亚型酶中，cyp3a4因其在人类代谢器官(肝脏和小肠)中的高丰度、广泛的底物谱和多样化的生物功能而备受关注。cyp3a4参与许多外源性物质(包括约50％的上市药物)和疏水性内源性物质的代谢，进而在调节药物治疗效果和内源性胆汁酸、胆固醇等代谢稳态中发挥着重要作用。目前，几种已上市的cyp3a4抑制剂(如利托那韦)已被证明可延长cyp3a4底物药物(如组合药物kaletra、奈玛特韦片/利托那韦片组合包装)的代谢半衰期，并具有令人满意的体内效应。此外，作为在肿瘤细胞和一些肿瘤组织中过表达的酶，cyp3a4也被认为是引发一些重要的抗肿瘤药物(如紫杉醇、多烯紫杉醇和长春新碱等)耐药的一个关键蛋白。强效cyp3a4抑制剂或灭活剂可以增强cyp3a4底物药物(如多烯紫杉醇、紫杉醇和长春新碱)的敏感性，并通过阻断细胞内cyp3a4的催化活性来克服多药耐药。

2、在过去的几十年里，cyp3a4的几种特异性药物底物和生理底物(如睾酮、蟾毒灵、咪达唑仑、华法林等)已被广泛用于检测cyp3a4活性和评估cyp3a4抑制剂的抑制作用。cyp3a4的药物/生理底物及其氧化代谢产物通常使用液相色谱-质谱法(lc-ms/ms)进行定量，这需要昂贵的设备和专业操作人员，且分析耗时。相比之下，光学底物具有灵敏度高、易于使用和高通量等优点，为酶功能的原位检测和成像以及酶调控剂的高效筛选提供了强大的工具。近年来，已经有cyp3a4的光学底物被开发，然而对于目前常用的两个光学底物，n-乙基-1,8-萘酰亚胺可在体外组织制备物层面评估cyp3a4的活性，在活细胞中的成像效果较差，而cyp3a4的生物发光底物则需要借助昂贵的荧光素酶检测。值得注意的是，超过一半的cyp3a4底物药物是可口服使用的药物，并且对肠道hcyp3a4的强烈抑制也可能导致具有临床意义的中药/药物-药物相互作用。因此，工业界和学术界迫切需要开发更实用且可口服使用的分子工具来取代cyp3a4药物底物(如咪达唑仑、华法林、硝苯地平)，来评估候选药物和中草药的体内cyp3a4抑制作用。

3、借助cyp3a4强效抑制剂数据库，我们设计了一类n-(4-噻唑甲氨基)-萘酰亚胺类的cyp3a4荧光底物，该类底物经cyp3a4羟化后可生成荧光发射光谱不同于底物的氧化代谢产物。该类底物还具有特异性高、代谢产物单一且易于使用、亲和力高且符合米氏动力学、适于高通量检测等优势。使用该底物构建了相应的cyp3a4活性检测方法，该方法在cyp3a4重组单酶、商品化细胞/组织制备物、细胞上清液/其他生物样本中均能定量检测cyp3a4的活性，具有操作简便、灵敏度高、抗干扰性强、特异性好等优点。快速的转化率、优异的灵敏度和功能成像效果使其应用前景比现有的分子工具更为广阔。

技术实现思路

1、针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一类用于检测人细胞色素p4503a4(cytochrome p450 3a4)酶活性的荧光底物及其制备方法和应用，所述的这种用于检测人细胞色素p450 3a4(cytochrome p450 3a4)的荧光底物及其制备方法和应用要解决现有技术中无法在细胞及活体层面的复杂生理/仿生条件下进行检测与成像的技术问题。

2、本发明提供了一种人细胞色素p450 3a4的荧光底物，为n-(4-噻唑甲氨基)-萘酰亚胺类化合物，其结构通式如式(1)所示：

3、r为h、甲基或者异丙基。

4、本发明还提供了上述的一类人细胞色素p450 3a4的荧光底物的制备方法，以1,8-萘二甲酸酐和4-噻唑甲胺盐酸盐或其衍生物为原料，在无水乙醇中加热回流后获得n-噻唑基-1,8-萘酰亚胺类化合物粗品，然后经过色谱分离后获得纯产物。

5、本发明还提供了上述的化合物在检测生物样本中人细胞色素p450 3a4的活性或残余活性中的用途。

6、进一步的，上述的人细胞色素p450 3a4的荧光底物被人细胞色素p450 3a4特异性催化发生c-4羟化反应并产生单一的4-羟化产物，通过检测人细胞色素p450 3a4的荧光底物在单位时间内的消除或4-羟化产物的生成量来定量检测生物样本中人细胞色素p4503a4的活性或残余活性。

7、

8、进一步的，人细胞色素p450 3a4的荧光底物被人细胞色素p450 3a4催化后产生的羟化产物可显示与底物不同的发射光谱，其底物的激发波长300～370nm和发射波长350～430nm；产物激发波长410～490nm，发射波长在500～600nm。

9、本发明还提供了一种检测生物样本中人细胞色素p450 3a4活性的方法，采用上述人细胞色素p450 3a4的荧光底物，在生理条件下将待测样品和底物混合后加入nadph起始反应；孵育5-60分钟后借助荧光检测设备检测底物在单位时间内的消除或4-羟化产物的生成量进而定量评估生物样本中人细胞色素p450 3a4的活性。

10、进一步的，所述待测样品包括但不限于人细胞色素p450 3a4重组单酶、表达人细胞色素p450 3a4的各类细胞或细胞制备物、过表达人细胞色素p450 3a4的工程细胞或其制备物，或者商品化的组织制备物。

11、本发明还提供了一种人细胞色素p450 3a4调控剂的筛选和评价方法，采用上述人细胞色素p450 3a4的荧光底物用于测定任意待测化合物对人细胞色素p450 3a4活性的调控作用(包括抑制、激活、灭活和诱导作用)。

12、进一步的，以上述人细胞色素p450 3a4的荧光底物为探针底物，在生理条件下将含有人细胞色素p450 3a4的生物样品和待测化合物混合后温孵3-33分钟，然后加入底物起始反应；孵育5-60分钟后终止反应，利用底物在单位时间内4-羟化产物的生成速率并与无待评价化合物组的产物生成速率比较，获得待测化合物对人细胞色素p4503a4的调控能力。

13、进一步的，所述含有人细胞色素p450 3a4的生物样品可选择人细胞色素p450 3a4重组单酶、表达人细胞色素p450 3a4的各类细胞或细胞制备物、过表达人细胞色素p4503a4的工程细胞或其制备物，或者商品化的组织制备物。

14、所述待测化合物为：cyp3a4的调控剂，测的是调控剂对cyp3a4的调控能力(抑制、激活、灭活和诱导作用)。cyp3a4特异性荧光底物经过酶(不同来源的cyp3a4)代谢产生4-羟化代谢产物，该产物在指定的激发波长下可发出荧光。利用底物在单位时间内产物的生成速率并与无待测化合物组的产物生成速率比较，获得待测化合物(调控剂)对cyp3a4的调控能力。

15、本发明的人细胞色素p450 3a4特异性荧光底物可被cyp3a4特异性氧化为相应氧化产物并显示与底物不同的发射光谱。本发明的底物作为cyp3a4的特异性底物，可以发生4-羟化代谢反应，通过定量检测单位时间内羟化产物的生成量来测定不同酶源中cyp3a4的活性。

16、本发明可通过评估cyp3a4重组单酶、商品化细胞/组织制备物等生物产品中cyp3a4的活性进而对上述产品进行质控。

17、本发明还可测定任意待测化合物对cyp3a4重组单酶、商品化细胞/组织制备物等生物产品中cyp3a4活性的调控作用(包括抑制、激活、灭活和诱导作用)，所述生物产品包括但不限于cyp3a4重组单酶、表达cyp3a4的各类细胞或细胞制备物、过表达cyp3a4的工程细胞或其制备物，以及商品化的组织制备物。

18、本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。选用本发明所述cyp3a4特异性荧光底物检测cyp3a4酶活性具有以下优势：

19、(1)特异性好且代谢产物单一：该类底物可被cyp3a4高特异性地代谢并生成单一的代谢产物，即c-4位羟化产物。

20、(2)亲和力高：该类底物与cyp3a4具有高亲和力，km小于20微摩。

21、(3)产物易于检测：该类底物及其氧化代谢产物具有不同的荧光发射光谱特征，能较好的进行区分检测；同时该类底物的4-羟化产物在500～600nm具有很强的荧光发射信号，可借助配有荧光检测器的任意设备检测。

22、(4)检测通量高：利用该类荧光底物建立的抑制剂筛选方法可实现96、384孔板的高效快速实时检测，可实现每日2万个样品的高通量检测，具有单个测试成本低廉(<0.5元)的优势。

23、(5)底物和产物均易于合成：1,8-萘酰亚胺类衍生物及其氧化产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行。