一种布鲁氏菌特异性融合抗原及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种布鲁氏菌特异性融合抗原及其应用。

背景技术：

1、布鲁氏菌病简称布病，又被称为地中海弛张热，马耳他热，波浪热或波状热，是由革兰氏阴性菌布鲁氏菌引起的人畜共患病，严重威胁人类健康和财产安全。布鲁氏菌病会导致病人反复高热、大汗、乏力、关节痛、肝脾及淋巴结肿大等症状，严重时会出现关节损害、脑膜炎、睾丸炎和卵巢炎等，不及时治疗会危及生命。该病感染的家畜主要是羊，牛和猪，会导致家畜流产、不孕或生殖器官炎症，严重威胁畜牧业发展。布鲁氏菌病主要通过皮肤和黏膜接触、消化道、呼吸道引起感染，接触病畜较多的人群易感染。

2、布鲁氏菌是革兰氏阴性、需氧、细胞内寄生的短小球杆状细菌，无鞭毛和菌毛，不运动，不形成芽孢，仅光滑型（致病毒株）有微荚膜。布鲁氏菌属于 α-变形杆菌属，主要分为6个生物种和19个亚型：羊种布鲁氏菌（ b.melitensis，生物型1-3）、绵羊型副睾种布鲁氏菌（ b.ovis，生物型1）、牛种布鲁氏菌（ b.abortμs，生物型1-8）、沙林鼠种布鲁氏菌（ b.neotomae，生物型1）、猪种布鲁氏菌（ b.sμis，生物型1-5）和犬种布鲁氏菌（ b.canis，生物型1）。之后又发现了田鼠种布鲁氏菌（ b.microti），鳍型布鲁氏菌（ b.pinnipedialis）和鲸型布鲁氏菌（ b.ceti）等。最早发现的羊种布鲁氏菌因其致病性最强，故而成为研究的重点菌株。

3、不同种的布鲁氏菌基因组组成和大小很相似，基因组都是2条染色体，平均长度大约3.39mb。布鲁氏菌的结构相对其他细菌很独特，不含编码质粒，荚膜，菌毛和内毒素的基因，与寄生的宿主细胞相互作用的研究也较少。布鲁氏菌细胞膜由三层膜构成，由内向外分别为细胞质膜、外周胞质膜和外膜。其中外膜是由脂多糖、蛋白质和磷脂三种组分构成，与肽聚糖（peptidoglycan，pg）层紧密结合形成细胞壁。布鲁氏菌的脂多糖lps是主要的毒力因子，已有的大部分抗体检测都是提取脂多糖作为抗原使用，但是由于布鲁氏菌能感染人，需要在生物安全p3级别的实验室培养，因此脂多糖的来源很受限制。除此之外，布鲁氏菌外膜蛋白omp也是重要毒力因子，已有的多项研究证实，布鲁氏菌多种外膜蛋白，包括omp10，omp16，omp19，omp25，omp31和omp28（也称bp26）都可以作为靶标抗原来检测布鲁氏菌的抗体水平。已发表的研究证实的可用抗原还包括分泌蛋白virb12，dna结合蛋白dps和转运蛋白wzt等。

4、布鲁氏菌病分布的广泛性，高度的传染性使其防控具有很高的难度，对人的健康和畜牧业经济带来了严重威胁，目前目前并无特效治疗，以扑杀和销毁为主。在此情形下，预防和检测显得尤其重要。现有的布鲁氏菌病检测方法主要包括病原学检测和血清学检测两类。

5、病原学检测方法包括病原分离鉴定和分子生物学检测等。病原分离和鉴定是诊断布鲁氏菌病最经典的方法，布鲁氏菌的分离方法已经非常成熟，但对实验人员和环境设施要求较高，需要在生物安全p3级别实验室进行，同时布鲁氏菌生长缓慢，首次分离检测周期较长（5-10天），该方法不适合一般实验室检测。

6、分子生物学方法已成为当前布鲁氏菌病检测和诊断的重要手段之一，包括聚合酶链式反应pcr，实时定量pcr和多重pcr等。这些方法具有特异、敏感和高效等优点，但是通常需要专用的检测仪器，同时对检测的环境要求较高，并不十分适用于基层检测。

7、血清学检测方法因为其简单、方便的特点，是现阶段布鲁氏菌病检测和诊断的主要方法。我国现行布鲁氏菌病诊断标准中规定的血清学检测方法有试管凝集试验（sat）、补体结合实验（cft）、虎红平板凝集试验（rbt）、全乳环状试验（mrt）、胶体金免疫层析技术（gica）和酶联免疫吸附试验（elisa）等。

8、试管凝集试验sat是1897发明的古老而经典的布鲁氏菌病检测方法，操作简单，判定简便，是我国法定方法之一。但是该方法存在一定漏检和误诊的可能，需要配合多种诊断方法来确诊。

9、补体结合实验cft也是我国法定方法之一，同时有国际标准，在国际贸易中用于布鲁氏菌病的确认。但是其实验操作复杂，结果需要实验人员主观判断，不适合大规模现场检测。

10、虎红平板凝集试验rbt操作简单，几分钟即可判读结果，成本低，适合群体的大规模普查。但是该方法敏感性有限，特异性较差，容易出现假阳性，所检出的阳性结果需要其他特异性检测方法进一步验证。

11、全乳环状试验mrt主要用于牛奶样品的筛查，操作简单，适合快速、大批量地检测样品，多用于大型奶牛场的现场筛查。该方法灵敏度有限，奶样质量不好时容易出现假阳性。

12、胶体金免疫层析技术gica特异性强，操作简便快速，肉眼直接观察结果，无需特殊试剂和仪器，便于单个样品检测，适合基层初步检测。

13、酶联免疫吸附试验elisa具有特异性强、灵敏度高、适用范围广、检测速度快等优点，可用于病菌抗原或动物血清中抗体检测，已广泛应用于兽医临床和宠物医院中。

14、上述各种方法各有其优缺点，制备出布鲁氏菌特异性抗原蛋白，作为抗体检测elisa方法和胶体金免疫层析法的原料，同时可以制备特异性单克隆抗体，为建立抗原检测的elisa方法和胶体金免疫层析法提供优质原料，对于临床准确检测其抗体和抗原水平有着重要意义。

技术实现思路

1、为此，本发明实施例提供一种布鲁氏菌特异性融合抗原及其应用。

2、为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

3、第一方面，一种布鲁氏菌特异性融合抗原，其特征在于，所述特异性融合抗原为外膜蛋白omp16从n端起第64-162位氨基酸残基和omp19从n端起第76-177位氨基酸残基以及omp28从n端起第29-250位氨基酸残基连接形成；所述特异性融合抗原的氨基酸序列如seqid no.7所示。

4、第二方面，布鲁氏菌特异性融合抗原的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.8所示。

5、第三方面，一种制备布鲁氏菌特异性融合抗原的方法，其特征在于，使用原核大肠杆菌表达系统进行表达。

6、第四方面，下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：

7、（a1）含有上述所述的特异性融合抗原编码基因的表达盒；

8、（a2）含有上述所述的特异性融合抗原编码基因的重组载体；

9、（a3）含有上述所述的特异性融合抗原编码基因的重组菌；

10、（a4）含有上述所述的特异性融合抗原编码基因的转基因细胞系。

11、第五方面，本发明提供上述所述的羊布鲁氏菌特异性融合抗原和/或特异性融合抗原编码基因和/或上述所述的生物材料在制备抗原中的应用。

12、第六方面，本发明提供上述所述的羊布鲁氏菌特异性融合抗原在羊布鲁氏菌抗体检测试剂盒和检测试纸条中的应用。

13、优选地，所述试剂盒为夹心elisa抗原检测试剂盒或竞争elisa抗体检测试剂盒；

14、优选地，所述试纸条为胶体金检测试纸条，或荧光微球检测试纸条，或乳胶微球检测试纸条。

15、本发明实施例具有如下优点：

16、本发明根据根据已有的蛋白质三维结构，对羊布鲁氏菌外膜蛋白omp16、omp19和omp28的结构进行分析，选择优势抗原表位通过柔性无规则卷曲序列连接形成融合抗原，使用原核大肠杆菌表达系统进行表达，经过免疫学实验验证，该抗原蛋白可以很好地结合抗体，蛋白活性高，可用于制备高敏感性的诊断试剂盒，以及建立高敏感性的诊断方法。该融合抗原相比已有常用抗原，稳定性更好，表达量更高，成本更低，检测抗体水平的特异性和灵敏度都更好。本发明所提供制备的elisa抗体检测试剂盒和胶体金检测试纸条特异性好、敏感性高、稳定性强，可以应用于羊布鲁氏菌病抗体的检测。