一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的咖啡短体线虫的快速检测方法

本发明属于植物病原真菌的田间快速实时可视化检测，具体涉及一种基于rpa-crispr/cas12a的咖啡短体线虫的快速检测方法。

背景技术：

1、短体属线虫又称为根腐线虫，是一类寄生性植物病原线虫，短体属线虫可以寄生在多种作物，在我国受短体属线虫危害所报道的作物有玉米、小麦、大豆、花生、番茄、烟草、山药等（刘海璐,王暄,李红梅等.我国黄淮麦区10个短体线虫样品种类的分子鉴定[j].中国农业科学,2018,51(15):78-92.）。

2、近年来，规模化种植不断发展，伴随而来的一些问题日益突出，特别是作物病害，由短体属线虫引起的根腐线虫病是其中之一。为了有效的减轻线虫病害，提高农作物的产量，解决线虫病害问题迫在眉睫，对于线虫病害，准确的诊断对于防控策略的制定至关重要。咖啡短体线虫属于短体属的一种，由于短体属线虫对作物造成的损伤在外观上大致相同，因此从发病症状上不能在其种水平做出明确判断，必须通过对线虫形态学以及分子生物学途径进行进一步的确定（李敏,叶建仁,陈凤毛.松材线虫检测技术研究进展[j].中国森林病虫, 2022,41(03):52-58.）。

3、crispr/cas系统是基于原核生物的一种适应性免疫系统，通过储存过往的感染记忆来提供针对外源遗传物质的特异性保护，从而保护细菌免受病毒入侵（chen j s, ma e,harrington l b, et al. crispr-cas12a target binding unleashes indiscriminatesingle-stranded dnase activity[j]. science, 2018, 360(6387): 436-439.）。近年来，相比于普通pcr的琼脂糖凝胶电泳检测方法和qpcr的荧光实时监测系统，基于crispr/cas系统的核酸检测技术具有时间短，所需仪器价格低廉，对操作人员要求低等优点。目前，基于crispr/cas12a核酸检测技术在不断被改进，并且得到了广泛应用，它的原理是cas12a是一种具有核酸酶内切活性的蛋白分子，cas12a可以和crrna形成复合体，该复合体可以识别富含胸腺嘧啶t的pam序列（5′-tttn-3′），使crrna与靶基因特异结合，随后cas12a的核酸内切酶活性被激活，能够水解体系中添加的非特异性荧光探针继而释放出荧光信号，该荧光信号既能够被qpcr仪捕获，也能够在紫外线/蓝光/可见光下直接观察到，因而能够用来检测靶基因的存在。

4、目前，基于crispr/cas12a的检测技术已在非洲猪瘟病毒（asfv）（wang x, he s,zhao n, et al. development and clinical application of a novel crispr-cas12abased assay for the detection of african swine fever virus[j]. bmcmicrobiology, 2020, 20(1): 1-10.）、马铃薯y病毒（何雨龙,王佳歌,赵珊珊,高锦,常英英,赵喜亭,聂碧华,杨清香,张江利,李明军.马铃薯y病毒rpa-crispr/cas12a检测技术体系的建立与应用[j].植物学报,2022,57(03):308-319.）、苹果茎沟病毒（孔康康. 基于crispr-cas12a技术的苹果茎沟病毒快速、低成本检测体系的开发与评价[d]. 河南农业大学, 2021.）、稻瘟病原菌（kang h, peng y, hua k, et al. rapid detection of wheatblast pathogen magnaporthe oryzae triticum pathotype using genome-specificprimers and cas12a-mediated technology[j]. engineering, 2021, 7(9): 1326-1335.）等多种病原体上得到应用，但在植物病原咖啡短体线虫的检测上还未见相关报道。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的一些局限，设计了一种基于rpa-crispr/cas12a的咖啡短体线虫的快速检测方法，该检测方法快速高效，操作简单，并且不依赖于离心机、pcr仪等大型仪器，能够实现对咖啡短体线虫的快速检测。

2、本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种基于rpa-crispr/cas12a的咖啡短体线虫的快速检测方法，其特征在于具体过程为：采集疑似感染线虫病害的植物组织为材料进行线虫dna粗提取得到线虫dna粗制提取液，再将线虫dna粗制提取液加入到rpa扩增体系中进行rpa扩增反应，待扩增反应结束后将rpa扩增反应产物和 taqman荧光探针加入到crispr/cas12a反应体系内进行反应，再将反应体系置于蓝光led灯下照射，如有荧光则为阳性结果，无发光则为阴性结果；

3、所述rpa扩增体系中rpa引物序列为：

4、pcrf：5’-ccgatgagatggaaacggacagagctagcgtatc-3’

5、pcrr：5’-caaagccttgccccaatgtggtgaacacccagaa-3’；

6、所述crispr/cas12a反应体系的组成为：

7、nebuffer4 2 μl、crrna 0.75 μm、cas12a重组蛋白0.375 μm和rnase inhibitor10 u，rnase free ddh2o补至16.2 μl，将混合组分于37 ℃加热5 min，促进crrna与cas12a形成二元复合物即形成crispr/cas12a反应体系；

8、其中crrna的全长核苷酸序列为：

9、pc-crrna：uaauu ucuac uaagu guaga caggu ggagu gcguu gaggc aucc；

10、 taqman荧光探针的序列为5’-fam-ttatt-bhq-3’。

11、本发明所述基于rpa-crispr/cas12a的咖啡短体线虫的快速检测方法，其特征在于具体步骤为：

12、步骤s1，根据咖啡短体线虫的28s rdna的特异片段序列，用geneious prime软件进行特异性rpa引物设计，扩增片段长度为259 bp，其序列信息如下：

13、pcrf：5’-ccgatgagatggaaacggacagagctagcgtatc-3’

14、pcrr：5’-caaagccttgccccaatgtggtgaacacccagaa-3’；

15、在rpa扩增目的片段内，设计特异性crrna引物，其序列信息如下：

16、pc-crrna：uaauu ucuac uaagu guaga caggu ggagu gcguu gaggc aucc；

17、荧光报告探针选用 taqman荧光探针，即5’-fam-ttatt-bhq-3’；

18、步骤s2，采集疑似感染线虫病害的植物组织为材料进行线虫dna粗提取得到线虫dna粗提取反应液；

19、步骤s3，使用twist amp® dna amplification kits试剂盒对步骤s2得到的线虫dna粗提取反应液进行等温扩增反应得到rpa反应液；

20、步骤s4，将步骤s1得到的荧光报告探针和步骤s3得到的rpa反应液加入到crispr/cas12a反应体系中，于37 ℃反应20 min后，将其置于蓝光led灯下照射进行检测，黄色或黄绿色发光为阳性结果，无发光为阴性结果。

21、进一步限定，步骤s2中所述线虫dna粗提取过程中采用无酶水配制粗提取缓冲液，该粗提取缓冲液的组成为：0.5 mol/l naoh和6 wt% peg200；线虫dna粗提取的具体步骤为：在研钵内加入300 μl粗提取缓冲液，再加入20 mg疑似感染线虫病害的植物组织，常温下用研磨棒进行充分研磨后转移到1.5 ml离心管中，静置10 min，取上清即为线虫dna粗提取反应液。

22、进一步限定，步骤s3中所述rpa反应液的具体制备过程为：参照twist amp® dnaamplification kits试剂盒说明书进行操作，在一支无菌无酶的0.2 ml pcr管内逐一添加以下组分：步骤s2得到线虫dna粗提取反应液2 μl、rehydration buffer 29.5 μl、rpa上下游引物各2.4 μl和ddh2o 11.2 μl，混合均匀后加入干粉制剂，轻弹使其分散，再加入280mm mgoac溶液2.5 μl，于37 ℃反应30 min得到rpa反应液。

23、进一步限定，步骤s4中所述crispr/cas12a反应体系的具体制备过程为：取一支无菌无酶的pcr管，按照如下原料组成及配比进行配制，nebuffer4 2 μl、crrna 0.75 μm、cas12a重组蛋白0.375 μm和rnase inhibitor 10 u，rnase free h2o补至16.2 μl，将混合组分于37 ℃加热反应5 min，促进crrna与cas12a形成二元复合物即形成crispr/cas12a反应体系。

24、本发明检测咖啡短体线虫的技术方案，其产生的优点和有益效果为：

25、1、时间短，整个检测过程耗时1.5 h左右，常规pcr检测技术需要至少4.5 h，时间降低约67%；

26、2、操作简单、结果可视化，不依赖于实验用大型仪器。此过程中只需使用研钵、研磨棒、离心管、led灯等可携带材料物品，所需试剂亦为常规试剂；

27、3、反应温度为37℃左右，可在田间进行检测，简单快捷，节省成本。