一种多能干细胞球体的冷冻保存和复苏方法与应用与流程

本发明涉及生物，尤其是涉及一种多能干细胞球体的冷冻保存和复苏方法与应用。

背景技术：

1、ipsc-3d是指人诱导多能干细胞(hipscs)在三维的悬浮培养情况下形成多能干细胞球。ipsc-3d可以在体外适宜的条件下可快速增值，也可以稳定的目的诱导分化为三个胚层方向的类器官组织等，在组织工程、疾病建模和个性化医学方面都起了关键的作用是再生医学的核心。常见的以ipsc为种子进行细胞分化培养生产中，贴壁培养和悬浮培养是常见的两种方式。相比以单细胞为起始分化的贴壁培养，以ipsc-3d细胞球为起始分化的悬浮培养有很多优点，如悬浮培养的多能干细胞多呈球体状，易于操作处理和回收细胞，同时也利于充分利用培养空间和培养基，从而利于干细胞的营养均匀吸收。此外，相关研究表明胰岛、心肌和神经等类器官的细胞分化培养中，ipsc-3d悬浮分化培养的三维类器官纯化度更高。可见ipsc-3d在参与特定功能的类器官分化中起着关键的起始作用，也是未来发展的方向。然而出于临床和科学目的，优化有效的低冻存复苏作为种子的ipsc-3d的科学技术方法迫在眉睫。

2、相关技术中，ipsc-3d细胞冻存复苏技术常见有两种，第一种是酶消化后冻存，另一种是不消化直接冻存。其中ips-3d酶消化后冻存是目前常见的冻存细胞球类的方式，是将正悬浮培养的ipsc-3d，消化成单细胞，然后按照经典单细胞冻存方式进行冻存。经典的单细胞冻存方法，经过长时间的试验，相对稳定的存活率是有保证的。然而，由于ipsc-3d呈现实心球状态，加入消化酶对球体表面的细胞起作用快而内部的细胞消化慢，在相对的消化时间内，细胞球表面的细胞容易过度消化，球中内部的细胞可能是半消化状态或者是后面物理吹打成单细胞，然而以该消化后的细胞状态去冻存容易造成生物损伤，并且在复苏环节，单细胞需要铺matrigel辅助贴壁培养，成活率低，自发分化率高，甚至有一些不稳定的ipsc-3d需要传三代以上才能恢复正常干性。另一种ipsc-3d不消化直接冻存的方法，是指将小球直接收集后加入冻存液，在理想的情况下该方式是操作简易、节省时间，然而由于目前市面上并没有适用于直接冻存ipsc-3d的冻存液或者别的更有效的冻存ipsc-3d的方式，而往往选择上面的酶消化冻存方式。但由于ipsc-3d多呈球状，干细胞球内外细胞由于接触冻存液不均匀，在冻存于-80℃冰箱和液氮的环节中，内部起冰晶刺伤细胞，或者在复苏环节时，细胞球外膜受损，细胞求外周由于液氮气化导致起气泡诱发细胞球发生一些列的凋亡溃散现象。此外，由于维持细胞活率的需要，胎牛血清fbs也被大量用于添加到冻存液中，这样引入了异源成分，有潜在的动物性病原风险，不利于干细胞产品的临床申报和使用，并且fbs会导致多能干细胞的自发分化，降低多能干细胞的质量。

3、基于此，对于多能干细胞的大量冻存来说开发无异源、且能够提高细胞存活率和阳性率的冻存液是非常紧迫的需要。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了一种多能干细胞球体的冷冻保存和复苏方法，采用该方法进行细胞球冻存培养不需要添加异源蛋白血清(如胎牛血清fbs)，本冷冻保存方法和复苏方法搭配使用，即使多能干细胞球被长时间冻存后，仍能让其在复苏后快速恢复球体形状，不会溃散，而且细胞存活率高(存活率大于95％)，另外，其还能够维持与冻存前相当的细胞分化能力。

2、本发明还提出了一种上述冷冻保存和复苏方法在制备多能干细胞三维培养的细胞球或制备含多能干细胞冻存产品中的应用。

3、本发明还提出了一种多能干细胞球体的冷冻保存和复苏试剂盒。

4、本发明还提出了一种冷冻保存系统。

5、本发明的第一方面，提供了一种多能干细胞球体的冷冻保存和复苏方法，包括以下步骤：

6、s1、将多能干细胞球重悬于含麦芽糖和dmso的冻存液中进行细胞冻存；

7、s2、将冻存后的所述多能干细胞球进行解冻，去除所述冻存液，加入含人血白蛋白和rock抑制剂的复苏缓冲剂培养2～6h；

8、其中，所述解冻包括将多能干细胞球置于-85～-75℃条件下处理1～3h，然后再于37±2℃水浴条件下快融。

9、根据本发明实施例的冷冻保存和复苏方法，至少具有如下有益效果：采用本发明的ipsc-3d冷冻保存方法进行细胞球冻存培养不需要添加异源蛋白血清(如胎牛血清fbs)，且采用该冻存方法复苏后的细胞球中的细胞存活率高，达到95％以上，并且能够维持与冻存前相当的细胞分化能力。

10、此外，采用本发明ipsc-3d冷冻保存方法进行细胞球冻存后的细胞球经过复苏培养后，不会产生明显气泡，且细胞球能够保持完整球体形态。

11、在本发明的一些实施方式中，所述细胞冻存包括将所述多能干细胞球置于-85～-75℃下处理6～12小时后转入液氮冻存。

12、在本发明的一些优选实施方式中，所述细胞冻存包括将所述多能干细胞球置于-80±2℃下处理6～10小时后转入液氮冻存。

13、在本发明的一些更优选实施方式中，所述细胞冻存包括将所述多能干细胞球置于-80℃下处理8小时后转入液氮冻存。

14、在本发明的一些实施方式中，所述液氮冻存的时间可根据实验需求进行调整。

15、在本发明的一些实施方式中，所述快融的时间为15～60s。

16、在本发明的一些优选实施方式中，所述快融的时间为30～45s。

17、在本发明的一些实施方式中，所述冻存液包含终浓度为0.05～0.15m的麦芽糖、体积分数为8～12％的dmso和基础培养基。

18、在本发明的一些优选的实施方式中，所述冻存液包含终浓度为0.05～0.15m的麦芽糖、体积分数为8～12％的dmso和f12培养基。

19、在本发明的一些实施方式中，所述基础培养基选自psc培养基、mtesrtm1培养基、dmem培养基、rpmi1640培养基、f12培养基或dmem/f-12培养基中的至少一种。

20、在本发明的一些实施方式中，所述rock抑制剂包括y27632。

21、在本发明的一些实施方式中，采用离心法去除所述冻存液。

22、在本发明的一些实施方式中，所述离心的转速为350～450rpm，离心的时间为2～4min。

23、在本发明的一些实施方式中，所述离心的转速为400rpm，离心的时间为3min。

24、在该条件下进行离心可以恰好的把细胞球收集沉底后，同时也不至于物理损伤到细胞球。

25、在本发明的一些实施方式中，所述复苏缓冲剂包含体积分数为10％-20％的人血白蛋白、终浓度为1～10μm的rock抑制剂和基础培养基。

26、在本发明的一些实施方式中，所述基础培养基选自psc培养基、mtesrtm1培养基、dmem培养基、rpmi1640培养基、f12培养基或dmem/f-12培养基中的至少一种。

27、在本发明的一些优选实施方式中，所述复苏缓冲剂包含体积分数为15％-20％的人血白蛋白、终浓度为5～10μm的rock抑制剂和psc培养基。

28、在本发明的一些实施方式中，所述rock抑制剂包括y27632。

29、在本发明的一些实施方式中，所述多能干细胞球的直径为50～200μm。

30、在本发明的一些优选实施方式中，所述多能干细胞球的直径为50～150μm。

31、在本发明的一些实施方式中，所述多能干细胞球与所述冻存液的比例为40～80颗：100μl。

32、在本发明的一些优选实施方式中，所述多能干细胞球与所述冻存液的比例为50～60颗：100μl。

33、在本发明的一些实施方式中，所述培养2～6h后还包括离心去除复苏缓冲剂，然后加入基础培养基进行培养。

34、在本发明的一些优选实施方式中，所述基础培养基与所述多能干细胞球的比例为1ml：40～60颗。

35、在本发明的一些实施方式中，所述基础培养基选自psc培养基、mtesrtm1培养基、dmem培养基、rpmi1640培养基、f12培养基或dmem/f-12培养基中的至少一种。

36、本发明的第二方面，提供上述第一方面任一项所述冷冻保存和复苏方法在制备多能干细胞三维培养的细胞球或制备含多能干细胞冻存产品中的应用。

37、本发明的第三方面，提供了一种多能干细胞球体的冷冻保存和复苏试剂盒，包含含有麦芽糖和dmso的冻存液，以及含人血白蛋白和rock抑制剂的复苏缓冲剂。

38、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒的使用方法包括第一方面任一项所述的冷冻保存和复苏方法。

39、本发明的第四方面，提供了一种冷冻保存系统，包括：

40、冻存单元，用于执行第一方面任一项所述的多能干细胞球体的冷冻保存和复苏方法中的步骤s1；

41、复苏单元，用于执行第一方面任一项所述的多能干细胞球体的冷冻保存和复苏方法中的步骤s2；

42、培养单元，用于培养所述复苏单元获得的复苏后的多能干细胞球。

43、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。