人羊膜上皮细胞在制备肾脏类器官中的应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及体外获得人多潜能干细胞来源的肾脏类器官领域。

背景技术：

1、慢性肾脏病(chronic kidney disease，ckd)的患病率高达10％，给个人及社会带来了巨大的负担，目前除了透析和肾移植，仍没有有效的治疗方法。然而透析只能延缓疾病进展，唯一能实现治愈的肾移植又面临器官供体严重不足的现状，迫切需要找到新的有效治疗方案。研究ckd的发病机制有助于找到新的潜在治疗靶点，首要条件是建立有效的疾病模型。肾脏由多种细胞类型组成，具有复杂的生理结构，传统的体外细胞模型往往是单一的永生化细胞系，无论是基因表达谱、生理功能，还是在生理结构上都无法与体内肾脏相比；而动物模型与人存在种间差异，亦无法真实模拟人体，因此亟需一种能够更为真实模拟人体内肾脏器官的体外模型。

2、肾脏类器官是利用具有多潜能的人多潜能干细胞模拟体内肾脏器官发育，在体外分化进而获得。其不仅具有人类遗传背景，能够规避动物模型带来的种间差异，更产生出与体内对应器官相似的复杂三维结构及功能，具有单一类型的细胞系或原代细胞所不具备的优势。因此是模拟肾损伤疾病表型、筛选治疗药物及预测人体对潜在药物反应的理想体外模型。目前肾脏类器官领域的瓶颈问题包括：整体成熟度欠缺、血管化水平以及批次间稳定性不足，本领域已报道工作尝试从不同角度解决以上问题：

3、(1)有研究报道通过将肾脏类器官移植到健康活体宿主体内，能够提升肾脏类器官的成熟程度与血管化水平。例如将肾脏类器官移植到免疫缺陷小鼠的肾被膜下，移植物表现出足细胞成熟以及与宿主的血管网络连接等现象；另有研究将肾脏类器官移植到鸡胚的绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane)中，移植物表现出成功的植入、血管化、多血管和血液循环。但对这些移植后的肾脏类器官进一步的检测发现，其肾小球内的大多数血管内皮细胞来自宿主动物，而不是来自移植物。这个现象提示了通过动物体内移植方法存在的潜在问题：肾脏类器官里的细胞发育需要依赖细胞间通讯，如足细胞与血管内皮细胞之间的相互作用促进彼此进一步成熟。如果移植物里的内皮细胞主要来自作为宿主的动物，考虑到例如物种间的差异，此时细胞间通讯并不能真实反映人体内肾脏发育，因此移植物的进一步发育可能会在错误的信号作用下发生偏差。另外，本技术方法依赖动物体内移植，造成了操作复杂、成本高，以及不适合高通量应用的不足。

4、(2)有研究报道利用微液流技术显著提高体外培养的肾脏类器官的成熟程度与血管化水平。微液流技术(microfluidics)是一种微流体操控技术。由于传统细胞培养方法的操作环境与体内环境相差甚远，难以客观真实地反映生理状态下细胞的生物学特征。微液流能一定程度模拟体内微环境，例如提供在静止培养条件下缺少的流体剪切力等对肾脏类器官分化有重要作用的因素。一项研究证明在微流体装置上的流动条件下培养肾类器官会诱导类器官内可灌注的血管网络形成，支持了液体流动在诱导血管化中的作用，并且血管化水平与流体速度呈正相关。在该系统中培养的肾单位细胞，包括足细胞和肾小管上皮细胞，比在常规静态条件下培养的肾单位细胞表达更高水平的谱系标志物，这可能是由于它们与水平提升的血管内皮细胞间产生了通讯与互作从而进一步成熟了。该研究提示微液流对于肾脏类器官体外成熟的具有显著作用。该技术方法的弊端在于对微液流装置的依赖使得其技术门槛、成本高，难以重复与推广。

5、(3)有研究使用基于“挤出三维细胞生物打印”的技术来制造具有高通量及高可重复性的肾脏类器官。体外制造用于药物研发的类器官时，可靠性和可重复性是至关重要的。为实现这一点，需要探索从不同hpsc细胞系及不同实验批次间稳定获得个体差异小的类器官产物的方法。一项研究证明通过使用“挤出三维细胞生物打印”(cellular extrusionbioprinting)技术，可提高肾脏类器官产物的可重复性，在显著提高通量的同时，也减少了产物间细胞数量，直径和细胞活性的差异。该技术方法的弊端在于对3d打印装置的依赖提高了肾脏类器官的技术门槛与制造成本。

6、因此，本领域迫切需要开发出制备成熟度较高，稳定性较好的肾脏类器官的应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对人多潜能干细胞来源的肾脏类器官整体成熟度欠缺、血管化水平不足的问题，提供了一种利用人羊膜上皮细胞(human amnioticepithelial cells,haecs)，在制备肾脏类器官的过程中的应用。

2、本方面的第一方面，提供人羊膜上皮细胞在制备肾脏类器官中的应用，所述制备肾脏类器官的饲养层细胞为人羊膜上皮细胞。

3、上述肾脏类器官分化至第6天到第16天时，与人羊膜上皮细胞共同培养。

4、上述肾脏类器官为人多潜能干细胞来源的肾脏类器官。

5、上述人羊膜上皮细胞密度为1×104/cm2。

6、上述人多潜能干细胞向肾脏类器官分化的第6天至到第16天期间，持续使用1×104/cm2人羊膜上皮细胞作为饲养层细胞进行共培养。

7、上述人多潜能干细胞来源的分化产物培养在transwell小室的上层，人羊膜上皮细胞培养在小室下层。

8、本发明第二方面，提供人羊膜上皮细胞在制备肾脏类器官疾病模型中的应用，所述制备肾脏类器官疾病模型的饲养层细胞为人羊膜上皮细胞。

9、上述肾脏类器官为人多潜能干细胞来源的肾脏类器官。

10、上述人多潜能干细胞为携带致病突变的遗传性肾脏病患者的细胞经重编程获得。

11、上述患者的细胞为血液细胞或尿液脱落细胞。

12、上述肾脏类器官疾病为常染色体显性遗传肾小管间质肾病。

13、本发明第三方面，提供人羊膜上皮细胞在筛选肾脏类器官疾病的药物中的应用，首先，用人羊膜上皮细胞作为饲养层细胞制备肾脏类器官疾病模型，然后用所述肾脏类器官疾病模型与不同浓度的目标药物共培养，以正常肾脏类器官与不同浓度的目标药物共培养，分析比对二组的药物毒性和治疗效果，初步判断该目标药物是否具有治疗肾脏类疾病的效果，将有治疗效果的目标药物作为候选药物。

14、本发明所述目标药物为可能具有治疗肾脏类器官疾病作用的药物或其他待检测药物。

15、人多潜能干细胞来源的肾脏类器官是体外研究肾脏发育及疾病机制的理想模型，然而现阶段其整体成熟度欠缺、血管化水平以及批次间稳定性不足是制约肾脏类器官应用的瓶颈问题。体外缺乏体内发育所需的精细微环境是造成肾脏类器官与体内肾脏在结构与功能上差距巨大的重要原因。haecs是从胎盘上最靠近胎儿一侧的羊膜上分离而来的一种围产期细胞，可以表达多种细胞因子、免疫调控因子和神经营养因子。有研究证明haecs可作为“信号中心”调节灵长类动物胚胎发育。因此，haecs可为分化过程中的人多潜能干细胞提供模拟体内的发育微环境，应用于肾脏类器官的体外制备。因此，本发明首次将haecs应用于体外制备人多潜能干细胞来源的肾脏类器官，并能够促进其结构与功能的成熟，为研究肾脏发育及疾病机制提供了一种有价值的模型。

16、人多潜能干细胞向肾脏类器官的体外诱导共需要24天，期间培养在tranwell(0.4μm孔径规格)的上层小室的滤膜上。我们发现在day 6至day 16的时间段之间持续将1×104/cm2haecs培养于同一个tranwell的下层，与分化中的类器官进行共培养(附图，图1)可：

17、1)显著提升早期分化细胞(day 9)向肾脏谱系的命运特化，在分化过程中分化出更多的后肾间充质，肾囊泡，近端肾小管上皮细胞(ltl+)，足细胞(wt1+)与血管内皮细胞等。2)显著提升不同实验批次间获得肾脏类器官产物的稳定性。3)显著提升分化末期(day24)肾脏类器官产物的整体血管化水平与成熟程度。肾脏类器官产物的整体血管化水平与成熟程度标志物，haec共培养组分别是无haec共培养处理的对照组产物的1.4-3.3倍。4)对建立遗传性肾脏病患者来源的肾脏类器官模型具有关键影响。

18、常染色体显性遗传肾小管间质肾病(adtkd)是一种可导致慢性肾脏病的遗传性肾脏病，现阶段没有有效药物可以进行干预。目前adtkd缺乏能够展现疾病表型的可用模型，这对致病机制研究及潜在药物的开发造成了严重阻碍。为解决这一问题，本发明通过将adtkd的患者的尿液脱落细胞重编程得到诱导性多潜能干细胞(ipsc)，进一步结合haec共培养，建立了该患者来源的个性化adtkd肾脏类器官模型，为该类疾病的机制研究及药物开发提供了有价值的平台。本发明方案适用于早期肾脏类器官中肾上皮细胞和血管内皮细胞的发育，并在终末产物中产生肾脏生理性结构，包括管周毛细血管、肾小球毛细血管环和滤过屏障等。单细胞rna测序分析证实，与haecs共培养的终末产物实现了接近人胚胎肾脏25周相当的发育水平。此外，我们还证明了这一策略适用于稳定生成常染色体显性遗传性肾小管间质疾病(adtkd)患者来源的肾脏器官，其携带与患者相似的肾脏疾病表型。

19、综上，目前领域内可提升肾脏类器官成熟度的方法存在操作复杂，成本高昂的问题，且具备一定的技术门槛，尤其不适合高通量制备功能成熟的肾脏类器官。本发明制剂最大的优势在于，haec可从废弃的羊膜组织中大量获取，几乎不受细胞来源限制，只需在已有的肾脏类器官体外分化方案中的固定时间段内加入固定数量的该细胞制剂与发育中的肾脏类器官共培养即可，无需额外借助复杂的仪器设备或操作手段即可实现成熟度的显著提升，操作简便，成本降低，且适合未来大批量获得肾脏类器官，也适用于药物筛选等高通量应用场景。