一种高效嗜盐碱矿化菌株及其分离筛选方法和应用

本发明涉及高效嗜盐矿化菌株制备，尤其涉及一株高效嗜盐矿化菌株的分离筛选及其在盐渍土生物矿化修复中的应用方法。

背景技术：

1、土壤盐渍化、次盐渍化造成土壤质量和生产力水平下降，甚至造成土壤荒废和退化是当前社会每个盐渍化土壤分布国家都面临的问题。目前，盐渍化土壤的改良治理措施主要有：物理措施、化学措施、工程水利措施及生物措施等。物理措施主要有土壤深耕、平底、客土法、地面覆盖、秸秆隔离等，物理措施对于表层抑盐具有良好的效果，但是需要往土中添加较多的其它材料，材料成本高，局限性大，造成土壤原结构的破坏，不适宜大面积使用；化学措施是通过在盐碱土中添加化学改良剂，利用化学物质与土壤中的盐碱成分发生作用，改善土壤理化性质或者改变可溶性盐基成分从而达到改良的目的，化学改良方法配方多样、见效快，但是持续性差、副作用较大，容易引入新离子造成环境二次污染；工程水利措施主要是通过建立不同类型的排灌系统结合不同的排水方式从而达到降低地下水位、压盐、脱盐、排盐和维持水盐平衡的目的，工程水利措施对脱盐、洗盐过程中容易引起土壤中矿物质元素的流失，引起土壤次生盐渍化，而且水利措施淡水需求量大，我国是水资源较短缺的国家，因此不易大范围推广使用。以上改良方法能够实现短期内改善盐渍土的目的，但是存在破坏土壤结构、引起土壤二次污染、浪费水资源等问题，难以实现盐渍土的改良的可持续发展模式。微生物诱导碳酸盐沉淀(micp)技术是利用微生物自身的新陈代谢产生一种脲酶，脲酶细菌可以水解尿素，诱导碳酸钙沉积，使松散、细小的土颗粒黏结在一起，提高土的力学性能，是一种微生物固化手段。然而将微生物诱导矿化技术应用于盐渍土的改良还未见报道。

技术实现思路

1、本发明的目的在于一种高效嗜盐矿化菌株及其分离筛选方法，该菌株能利用盐碱土中微生物特有的功能性实现盐碱土的绿色生态修复，以解决上述背景技术中提出的问题，不但能实现盐渍土水盐运移的调控而且能进行土壤力学性能的改善。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

2、一种高效嗜盐矿化菌株，所述高效嗜盐矿化菌株分类命名为盐单胞菌halomonassp.xr2#，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.22116，保藏日期为2021年04月02日。其16s rrna基因序列如seq id no.1所示。经鉴定与halomonas caseinilytica kf668253.1的同源性达100％。

3、所述高效嗜盐矿化菌株，其分离自盐渍土。该菌株属于革兰氏阳性兼性厌氧菌，属于中度嗜盐菌以及兼性嗜碱菌，同时属于产脲酶矿化菌。所述高效嗜盐矿化菌株，该菌株最适生长氯盐浓度范围为1.0～2.5mol/l；耐氯盐浓度范围为0.5～3.5mol/l；耐硫酸盐浓度范围为0～1.0mol/l；耐碱范围为ph＝6.5～12。该菌株在固体培养基上呈不规则的液态水珠状形态，颜色呈乳白色，菌体为透明状梭形杆状，其长度为1.5μm～4.5μm，如图1所示。

4、所述的高效嗜盐矿化菌株的培养方法，所述高效嗜盐矿化菌株生长对数期为72h，最适培养条件为：培养温度37℃，培养转速200r/min，培养时间72h。。

5、所述的高效嗜盐矿化菌株的分离筛选方法，包括以下步骤：

6、步骤1：取盐渍土地表以下10～50cm范围内的土样，放入高温灭菌后的0.1m的na2co3-nahco3缓冲液中恒温震荡，震荡温度30～40℃，震荡频率150～200r/min，震荡时间5～10min，加入25％酵母液后继续震荡30～40min；培养获得细菌富集液；

7、步骤2：所述细菌富集液离心并用na2co3-nahco3缓冲液洗涤，去除细菌富集液中的酵母；所述细菌富集液在30～40℃、150～200r/min条件下，离心5～10min；

8、步骤3：用na2co3-nahco3缓冲液重新悬浮细菌富集液并制备成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的稀释溶液；

9、步骤4：不同浓度的稀释溶液分别涂布于表面具有固体培养基的平板上37℃～40℃恒温培养2d～3d，所述平板密封后放入恒温培养箱中培养；

10、步骤5：挑取固体培养基上清晰呈红色的单菌落继续接种至液体培养基中震荡培养，震荡温度37～40℃，震荡频率150～200r/min，ph为培养基自然ph，培养时长24～48h；

11、步骤6：取菌液进行矿化性能验证；

12、步骤7：选取矿化效果最好的单菌落继续接种到固体培养基中，经过反复划线，纯化培养，得到的单菌落为所述高效嗜盐矿化菌株盐单胞菌；

13、所述固体培养基成分为：每1000ml去离子水，包括60～80mm c3h5o3na、20～30mmnano3、0.1～0.4mm kh2po4、0～1mm feso4、350～500mm nacl、40～60mm mgcl2、15～25mmcacl2、20～30mm na2so4、5～10mm kcl、0～1mm kbr、0～0.5mm h3bo3、0～0.1mm naf、0～0.1mm srcl2、5～15ml sl-6微量元素液、10～15g agar、0.01～0.02g酚红；

14、所述液体培养基成分为：每1000ml去离子水，包括60～80mm c3h5o3na、20～30mmnano3、0.1～0.4mm kh2po4、0～1mm feso4、350～500mm nacl、40～60mm mgcl2、15～25mmcacl2、20～30mm na2so4、5～10mm kcl、0～1mm kbr、0～0.5mm h3bo3、0～0.1mm naf、0～0.1mm srcl2。

15、进一步的，所述矿化性能验证：将不同的单菌落放入液体培养基中培养24～48h后，接种5～10ml菌液至钙源溶液中，将出现白色沉淀的混合液静置24h，将上清液倾倒，用无菌蒸馏水洗涤去除沉淀物中的残留细菌，在40～50℃下烘干12～24h，即可获得沉积物样品；用1mol/l稀盐酸检测沉积物，如果沉积物中加入稀盐酸后立即有大量气泡产生，判断沉积物为碳酸钙沉淀，所述单菌落为具有矿化性能的菌落；所述钙源溶液包括0.5～1mol/l的尿素和0.5～1mol/l的二水氯化钙溶液。采用扫描电子显微镜(sem)观察判断所述沉积物的微观形貌；采用x射线衍射仪(x射线衍射仪)分析所述沉积物的晶体结构；采用能谱仪(eds)分析所述沉积物的化学组成。

16、所述的高效嗜盐矿化菌株在盐渍土生物矿化修复中的应用。包括以下步骤：

17、步骤1)：制备应用于盐渍土生物矿化修复的微生物矿化菌液及灌浆液：所述微生物矿化菌液由所述高效嗜盐矿化菌株盐单胞菌经扩培而成，所述菌液的od600值为1.0～2.0，脲酶活性为4～10mm urea/min；所述灌浆液由相互独立的胶结液及菌液固定液组成，所述胶结液成分为：urea 30～60g/l，nh4cl 10～15g/l，cacl2·2h2o 73.5～147g/l，nahco3 2～3g/l，nutrient broth 10～20g/l；所述菌液固定液为0.05～0.1mol/l的氯化钙溶液；所述胶结液和菌液固定液的溶剂均为水；

18、步骤2)：进行微生物注浆形成微生物矿化阻隔层改良盐渍土：所述微生物注浆包括步骤：首先对待改良修复盐渍土区域从上至下正向注浆注入1倍土体孔隙体积的微生物矿化菌液，静置1～3h后注入1倍土体孔隙体积的菌液固定液，静置8～12h后注入第一批胶结液，第一批胶结液注入量为2倍土体孔隙体积，反应36～48h后注入第二批胶结液，第二批胶结液注入量为2倍土体孔隙体积，至此完成第一轮注浆，间隔36～48h后进行下一轮注浆；注浆的注浆速率均为4～10ml/min，注浆深度范围为0～80cm，直至微生物矿化阻隔层厚度范围达到8～15cm，强度达到0.3～1.5mpa；

19、步骤3)：所述微生物矿化阻隔层通过阻隔盐分上升表聚实现对盐渍土的改良修复。

20、本发明的优点和有益效果是：

21、1、本发明提供的高效嗜盐矿化菌株，为嗜盐单胞菌(halomonas sp)xr2#菌株，为耐受型嗜盐矿化菌株，既可以耐受高盐碱环境，又能够诱导碳酸盐沉淀固化土颗粒，可以作为一种新型特殊环境下固化土壤的微生物菌种，环境耐受性好，固化强度高，有很好的研究和应用价值。

22、2、嗜盐单胞菌(halomonas sp)xr2#菌株为盐渍土自源矿化菌株，适用于盐碱类土壤的矿化和改良，可避免外源菌种对土壤环境的影响。

23、3、利用高效嗜盐矿化菌株结合微生物灌浆技术形成微生物矿化阻隔层，实现对盐渍土水盐运移的阻隔调控，进而实现盐渍土的修复改良，是一种新型的、有效的、符合可持续发展的环境友好型盐渍土的治理改良措施。