一种对干细胞分泌能力具有活化作用的组合物的制作方法

本发明属于干细胞，尤其涉及一种对于干细胞分泌能力具有活化作用的组合物。

背景技术：

1、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是一类具有广泛来源的多功能干细胞，其起源于发育早期的中胚层和外胚层。这些干细胞展现出成体干细胞的特征，包括自我更新和多向分化的潜能，使其成为治疗和再生医学领域备受瞩目的研究对象。

2、其中，脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，uc-mscs)作为一种来源广泛而可行的多功能干细胞，近年来引起了再生医学和细胞治疗领域的广泛兴趣。uc-mscs具有自我更新、多向分化、免疫调节和抗炎等特性，使其成为治疗多种疾病的理想细胞源。

3、然而，随着对uc-mscs的深入研究，越来越多的证据表明，其旁分泌物质(paracrine factors)可能是其治疗效应的关键因素。uc-mscs通过分泌一系列生物活性分子，包括细胞因子、生长因子、细胞外囊泡等，对周围组织和细胞发挥调节和促进修复的作用。因此，如何有效的提高uc-mscs的旁分泌能力是目前需要解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种对干细胞分泌能力具有活化作用的组合物，从而有效的提高脐带间充质干细胞的分泌能力。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

3、首先，本发明提供了一种对干细胞分泌能力具有活化作用的组合物，所述组合物由景天三七多糖a和景天三七多糖c组成。

4、优选地，所述组合物中所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c的质量比例为3:2，1:1或2:3。

5、优选地，所述组合物中所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c的合计浓度为20μg/ml。

6、优选地，所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c的制备方法包括如下步骤：

7、1)将干燥处理后的景天三七原料粉碎成均匀的粉末，制备得到景天三七粉末；

8、2)将景天三七粉末和无菌水按照1g：10ml的比例混合，搅拌均匀后，调整温度为40℃，100w超声提取30min，制备得到景天三七混合液；

9、3)将景天三七混合液置于离心机中，离心，得到景天三七浸提液；

10、4)采用真空旋转蒸发的方式，将景天三七浸提液浓缩为原体积的25％，加入4倍量的无水乙醇，置于4℃进行24h醇沉，得到景天三七沉淀；

11、5)将得到的景天三七沉淀加入无菌水配置成景天三七溶液；

12、6)使用sevage法进行5次重复去除景天三七溶液中的蛋白质，得到景天三七多糖溶液；

13、7)使用10kda的超滤膜对景天三七多糖溶液进行过滤，得到小于10kda的滤过液；

14、8)使用30kda的超滤膜对截留液进行过滤，得到10kda-30kda的滤过液和大于30kda的截留液；

15、9)将小于10kda的滤过液，大于30kda的截留液，加入无水乙醇使乙醇的终浓度为80％，4℃醇沉24h，冷冻干燥，得到所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c。

16、优选地，所述干细胞为脐带间充质干细胞。

17、优选地，所述干细胞分泌能力是指干细胞分泌bfgf，vegfa和sdf-1α的能力。

18、其次，本发明提供了一种组合物在制备提高脐带间充质干细胞分泌能力的细胞培养基中的应用，所述组合物由景天三七多糖a和景天三七多糖c组成，所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c由上述的所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c的制备方法制备得到；

19、所述组合物中所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c的质量比例为3:2，1:1或2:3。

20、优选地，所述组合物中所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c的合计浓度为20μg/ml。

21、优选地，所述脐带间充质干细胞分泌能力是指脐带间充质干细胞分泌bfgf，vegfa和sdf-1α的能力。

22、其次，本发明提供了一种提高脐带间充质干细胞分泌能力的细胞培养基，其特征在于，所述细胞培养基的制备方法包括如下步骤：

23、1)使用无血清的dmem培养基将景天三七多糖a和景天三七多糖c按照3:2，1:1或2:3的比例配置成含有20μg/ml景天三七多糖a和景天三七多糖c的dmem培养基；

24、2)将步骤1)得到的dmem培养基使用0.22μm的滤膜进行过滤除菌后，加入10％胎牛血清，得到用于提高脐带间充质干细胞分泌能力的培养基。

25、优选地，所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c由上述的所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c的制备方法制备得到。

26、其次，本发明提供了一种景天三七多糖在制备提高脐带间充质干细胞分泌能力的细胞培养基中的应用，所述景天三七多糖为景天三七多糖a或景天三七多糖c；

27、所述景天三七多糖a或所述景天三七多糖c由权利要求3中的制备方法制备得到；

28、所述脐带间充质干细胞分泌能力是指脐带间充质干细胞分泌bfgf，vegfa和sdf-1α的能力。

29、其次，本发明提供了一种组合物在制备提高脐带间充质干细胞中bfgf，vegfa和sdf-1α基因表达的细胞培养基中的应用，所述组合物由景天三七多糖a和景天三七多糖c组成，所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c由上述的所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c的制备方法制备得到；

30、所述组合物中所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c的质量比例为3:2，1:1或2:3。

31、优选地，所述组合物中所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c的合计浓度为20μg/ml。

32、其次，本发明提供了一种景天三七多糖在制备提高脐带间充质干细胞中bfgf，vegfa和sdf-1α基因表达的细胞培养基中的应用，所述景天三七多糖为景天三七多糖a或景天三七多糖c；

33、所述景天三七多糖a或所述景天三七多糖c由权利要求3中的制备方法制备得到。

34、其次，本发明提供了一种提高脐带间充质干细胞分泌bfgf，vegfa和sdf-1α能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

35、1)使用无血清的dmem培养基将景天三七多糖a和景天三七多糖c按照3:2，1:1或2:3的比例配置成含有20μg/ml景天三七多糖a和景天三七多糖c的dmem培养基；

36、2)将步骤1)得到的dmem培养基使用0.22μm的滤膜进行过滤除菌后，加入10％胎牛血清，得到用于提高脐带间充质干细胞分泌能力的培养基；

37、3)将脐带间充质干细胞接种于细胞培养皿中，加入所述用于提高脐带间充质干细胞分泌能力的培养基培养24-72h，收集上清提取bfgf，vegfa和sdf-1α。

38、优选地，所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c由上述的所述景天三七多糖a和所述景天三七多糖c的制备方法制备得到。

39、bfgf为基本成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor)，参与细胞增殖、分化、生存和血管生成等生理过程。

40、sdf-1α为基质细胞衍生因子1α(stromal cell-derived factor 1alpha)，参与调控细胞迁移、干细胞定向迁移以及血液和免疫系统中的多种生物学过程。

41、vegfa为血管内皮生长因子a(vascular endothelial growth factor a)，其在血管形成中发挥着关键作用。

42、本发明的有益效果在于：

43、1.本发明制备得到了不同分子量的景天三七多糖a，b，c(小于10kda、10-30kda和大于30kda)，检测不同景天三七多糖对bfgf、vegf和sdf-1α基因表达的影响，检测结果发现，景天三七多糖a和c能够促进bfgf、vegf和sdf-1α基因表达。

44、2.本发明将小分子景天三七多糖和大分子景天三七多糖按不同比例联用，发现联用能够协同促进bfgf、vegf和sdf-1α的基因表达，并且二者1:1比例联用时的促进作用最佳。

45、3.其次，本发明利用上述的性质制备了用于提高干细胞分泌能力的培养基和培养方法，从而可以有效的提高脐带间充质干细胞的分泌能力，使其可以更好的发挥治疗效果。