与菠菜Fe元素含量相关的KASP分子标记开发及其应用

本发明涉及分子遗传学，尤其涉及与菠菜fe元素含量相关的kasp分子标记开发及其应用。

背景技术：

1、菠菜(spinacia oleracea l.,2n＝2x＝12))属苋科藜亚科菠菜属植物，原产伊朗，是主要以绿叶为产品器官的一、二年生草本植物。因其适应性广、耐储藏、供应期长、栽培方式多样，营养比较全面，在世界各地普遍种植。

2、菠菜富含营养物质和促进健康的化合物，如维生素、矿质元素等，被认为是人类饮食中最健康的蔬菜之一。矿质营养元素是植物和动物生长发育所必需的营养元素，且人类只能通过植物性食物来获取。矿质元素分为大量元素和微量元素两种，其中微量元素包括cl、fe、mn、cu等。铁在人体和植物中都有重要作用。首先，在人体中，铁是血红蛋白与肌红蛋白、细胞色素以及一些呼吸酶的成分，参与体内氧与二氧化碳的转运、交换和组织呼吸过程。其次，对于植物而言，铁是叶绿素合成的催化剂，参与光合作用，并影响根系发育和整体生长。

3、目前，尚未开发与菠菜fe含量相关的分子标记，不利于菠菜高fe含量品种的选育。因此，本发明开发了与菠菜fe含量相关的kasp分子标记，用于选育理想的富含fe元素的菠菜品种。

技术实现思路

1、本发明提供与菠菜fe元素含量相关的kasp分子标记开发及其应用，用于选育富含fe元素的优质菠菜品种，缩短育种年限。

2、本发明提供一种与菠菜fe含量性状的分子标记，位点位置信息如下：

3、 标记 染色体 snp物理位置 等位基因 kmfe09 sovchr1 43602473 [c/a]

4、本发明标记kmfe09位于菠菜1号染色体上，物理位置为43602473bp，snp位点处碱基为c/a，碱基为c的菠菜植株为低fe含量植株，碱基为a的菠菜植株为高fe含量植株。

5、优选的，该标记的位置信息是根据菠菜全基因组序列而确定的,相关网址为http://spinachbase.org/ftp/genome/monoe-viroflay/。

6、本发明还提供一种引物组合，用于扩增所述分子标记；

7、优选的，包括第一引物、第二引物和第三引物；

8、所述第一引物的的核苷酸序列如seq id no.1(caatgtggtcaagtgtggcgg)所示；

9、所述第二引物的的核苷酸序列如seq id no.2(acaatgtggtcaagtgtggcgt)所示；

10、所述第三引物的的核苷酸序列如seq id no.3(5’-tataaaaatattgcggaagcttataactaaatcg-3’)所示。

11、本发明还提供一种kasp引物组合，包括第一引物(正向引物)、第二引物(正向引物)和第三引物(通用的反向引物)；

12、所述第一引物为上述第一引物的5’端加上a荧光对应的标签序列a；

13、所述第二引物为上述第二引物的5’端加上b荧光对应的标签序列b；

14、所述第三引物为上述第三引物；

15、所述a荧光与b荧光不同。仅检测到通用标签a荧光，为cc基因型，对应的是菠菜中fe含量较低；仅检测到通用标签b荧光，为aa基因型，对应的是菠菜中fe含量较高；如果同时检测到通用标签a和b荧光，为ca基因型，则对应的是菠菜中fe含量处于中间水平。

16、根据所述kasp引物组合，所述第一引物的的核苷酸序列如seq id no.4

17、(5’-gaaggtgaccaagttcatgctcaatgtggtcaagtgtggcgg-3’；其中gaaggtgaccaagttcatgct为通用标签a)所示；

18、所述第二引物的的核苷酸序列如seq id no.5(5’-gaaggtcggagtcaacggattacaatgtggtcaagtgtggcgt-3’；其中gaaggtcggagtcaacggatt为通用标签b)所示。

19、本发明还提供含有所述引物组合的产品，所述产品为检测试剂或试剂盒。

20、本发明还提供一种鉴定fe含量和/或fe含量基因分型的方法，以待检测的菠菜dna为模版，利用所述引物组合，根据引物扩增结果判断菠菜fe含量和/或fe含量基因分型；

21、优选的，根据荧光检测结果判断。

22、根据所述鉴定菠菜fe含量和/或fe含量基因分型的方法，包括以下步骤：

23、(1)提取待检测的菠菜dna；

24、(2)稀释步骤(1)中的dna到20ng/μl，并向其中加入特异的kasp primer mix和

25、(3)通用的kasp master mix，进行pcr扩增；pcr产物在低于40℃下进行荧光检测分析；

26、上述特异的kasp primer mix含所述的引物组合；

27、优选的，上述通用的kasp master mix包含如下组份：通用的tret cassette荧光引物、rox内参染料、kleartaq dna聚合酶、dntp和mgcl2。

28、根据所述鉴定菠菜fe含量和/或fe含量基因分型的方法，pcr反应体系如下：每10μl反应体系包括4.86μl模板dna、5μlkasp master mix和0.14μlkasp primer mix。

29、本发明提供的kasp基因分型通量大且操作简单，只需将特异的kasp primer mix和通用的kasp master mix加入到含有dna样本的pcr微孔反应板中，进行pcr扩增。最终结果采用荧光检测仪进行分析即可。

30、所述kasp primer mix含有3条特异引物：分别带有通用标签a和b的正向引物1和2，以及一条反向引物。

31、 组分 96孔板(μl) 384孔板(μl) 模板dna 4.86 2.43 kasp master mix 5 2.5 kasp primer mix 0.14 0.07 总体积 10 5

32、所述kasp master mix包含通用的fret cassette荧光引物，rox内参染料，kleartaq dna聚合酶，dntp和mgcl2等组分，已预置于优化的缓冲液中。其中荧光报告基团a为fam，荧光报告基团b为hex，所述kasp master mix是英国lgc公司产品。产品目录号为kbs-1016-002。

33、根据所述鉴定菠菜fe含量和/或fe含量基因分型的方法，pcr反应条件如下：

34、

35、

36、优选的，待荧光检测分型后，若分型结果不理想，可再进行如下pcr反应：

37、

38、第二次pcr反应结束后可再次进行荧光检测分析。

39、本发明还提供所述引物组合或所述产品在以下任一项或几项中的应用：

40、(1)在鉴定或者辅助鉴定菠菜fe元素含量中的应用；

41、优选的，用于苗期鉴定菠菜的fe含量特性；

42、(2)在菠菜fe元素含量的早期预测中的应用；

43、(3)在菠菜分子育种中的应用；

44、(4)在菠菜种质改良中的应用；

45、(5)在筛选菠菜fe元素含量中的应用；

46、(6)在菠菜fe元素含量基因分型中的应用。

47、本发明的有益效果：

48、本发明还提供与菠菜fe含量相关的kasp分子标记kmfe09辅助育种中的应用。

49、利用本发明提供的三条kasp引物可以在苗期对菠菜fe元素含量特性进行检测，其分析通量高，准确率高。本发明提供的共显性kasp标记有利于筛选富含fe元素的菠菜品种，预测菠菜的fe含量，大大加快了富含fe元素菠菜品种的选育，缩短育种年限。