一株产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的构建与应用

本发明涉及一株产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌的构建与应用，属于基因工程和发酵工程。

背景技术：

1、γ-氨基丁酸(gama-aminobutyric acid，gaba)，别名4-氨基丁酸，是一种水溶性的非蛋白质氨基酸，其分子式为c4h9no2。相对分子质量为103.01，为白色结晶性粉末，具有良好的热稳定性。gaba作为一种重要的抑制性神经递质广泛存在于脊椎动物，植物和微生物中。

2、gaba的生产方法主要包括化学合成法、酶或全细胞催化法以及微生物发酵法。化学合成法需要有机试剂的参与，不能应用于食品工业中，酶或全细胞催化法主要利用微生物表达谷氨酸脱羧酶，并通过直接添加前体l-谷氨酸或谷氨酸钠作为底物将其转化为gaba，该方法生产成本较高。

3、目前γ-氨基丁酸的生产的主要方法为微生物发酵法，谷氨酸棒杆菌是一株食品安全菌株，且具有很强的l-谷氨酸合成能力，是目前作为最具有gaba生产潜力的候选菌株，例如，专利cn113583930a公开了一株生产γ-氨基丁酸的谷氨酸棒杆菌，其发酵72h的gaba产量为58.3g/l。现有技术以谷氨酸棒杆菌微生物发酵法生产γ-氨基丁酸时，仍存在着发酵周期长，产量低的问题，因此，需要进一步提高gaba的产量，以满足工业生产的需求。

技术实现思路

1、为了解决上述存在的技术问题，本发明通过敲除谷氨酸棒杆菌基因组上编码海藻糖合成相关基因trey，并将谷氨酸棒杆菌中基因组上顺乌头酸酶基因的启动子替换为ptacm启动子，得到突变谷氨酸棒杆菌δtrey、ptacm-acna，谷氨酸棒杆菌δtrey、ptacm-acna菌株在发酵培养基中，gaba产量和葡萄糖转化率均有所提高。

2、本发明提供了一株重组谷氨酸棒杆菌，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌cgy-pg-304为出发菌株，敲除了出发菌株基因组上的以下一个或多个基因：琥珀酰辅酶a合成酶基因succd、酮基还原酶基因cmra、海藻糖合成酶基因trey，和/或强化表达了顺乌头酸酶acna。所述谷氨酸棒杆菌cgy-pg-304公开于中国专利cn113583930a。

3、在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌cgy-pg-304为出发菌株，敲除了出发菌株基因组上的succd基因。

4、在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌cgy-pg-304为出发菌株，敲除了出发菌株基因组上的cmra基因。

5、在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌cgy-pg-304为出发菌株，敲除了出发菌株基因组上的trey基因。

6、在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌cgy-pg-304为出发菌株，敲除了出发菌株基因组上的cmra基因和trey基因。

7、在一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌以谷氨酸棒杆菌cgy-pg-304为出发菌株，敲除了出发菌株基因组上的trey基因，并强化表达了顺乌头酸酶acna。

8、在一种实施方式中，所述succd基因、cmra基因、trey基因的gene id分别为3345089、58311118、1020069。

9、在本发明的一种实施方式中，所述顺乌头酸酶acna编码基因的gene id为23501674。

10、在本发明的一种实施方式中，所述强化表达是利用ptacm启动子表达顺乌头酸酶acna编码基因。

11、在本发明的一种实施方式中，所述ptacm启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示，或者所述ptacm启动子为：seq id no.1所示的序列经过一个或几个碱基的增添、替换或删除后仍具有启动子活性的多核苷酸。

12、本发明还提供了一种发酵生产γ-氨基丁酸的方法，所述方法是利用所述重组谷氨酸棒杆菌为发酵菌株，发酵生产γ-氨基丁酸。

13、在一种实施方式中，所述方法包括：将所述重组谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基，培养至od562为35～45，得到种子液，将种子液以5％～10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基，于30～35℃发酵培养。

14、在一种实施方式中，所述发酵培养基中含有一水合葡萄糖140-170g/l，可选的，含有一水合葡萄糖160g/l。

15、在一种实施方式中，所述发酵培养基中含有玉米浆1-4g/l，可选的，含有玉米浆3g/l。

16、在一种实施方式中，在发酵培养基初始时含有终浓度为1-8g/l的尿素，可选的，初始尿素含量为4g/l。

17、在一种实施方式中，在所述发酵10～20h期间，每1-5h补加终浓度为2-4g/l的尿素。

18、在一种实施方式中，所述方法包括：将所述重组谷氨酸棒杆菌接种于种子培养基，培养至od562为35-45，得到种子液，将种子液15％～30％(v/v)的接种量转接至发酵培养基，于30-35℃发酵培养。

19、在一种实施方式中，在所述发酵过程中，当葡萄糖浓度低于15～20g/l时，补加葡萄糖并维持其浓度不低于15～20g/l。

20、在一种实施方式中，在发酵的0～20h期间控制ph为6～8，在发酵的20～96h期间控制ph为4.5～6。

21、在一种实施方式中，所述发酵的溶氧为20％～40％。

22、在一种实施方式中，所述发酵的时间为不低于48h，可选的，发酵的时间为48～72h或72～96h或不低于96h。

23、本发明还提供了所述重组谷氨酸棒杆菌或所述方法在食品或化工领域中的应用。

24、在一种实施方式中，所述应用包括将所述重组谷氨酸棒杆菌或所述方法用于生产γ-氨基丁酸或含γ-氨基丁酸的产品。

25、有益效果：

26、(1)本发明构建的重组菌株cgw002～cgw005在32℃下72h的γ-氨基丁酸产率分别为0.52g/l/h、0.59g/l/h、0.57g/l/h和0.65g/l/h，相较于出发菌株cgy-pg-304(产率为0.44g/l/h)出现明显提高。

27、(2)本发明构建的重组菌株cgw002～cgw005在32℃下72h的γ-氨基丁酸产量分别为37.79g/l、42.44g/l、41.21g/l和46.91g/l，相较于出发菌株cgy-pg-304(产量为31.92g/l)出现明显提高。

28、(3)本发明构建的重组菌株cgw002～cgw005在32℃下72h的葡萄糖转化率分别为0.30g/g、0.33g/g、0.32g/g和0.37g/g，相较于出发菌株cgy-pg-304(产量为0.25g/g)出现明显提高，表明重组菌株能够更高效的将葡萄糖转化为γ-氨基丁酸，有利于节约原料，降低成本。

29、(4)本发明的重组菌株cgw005在发酵培养基初始一水合葡萄糖添加量为160g/l，玉米浆的添加量为3g/l的条件下，在32℃发酵48h的gaba产量为52.36g/l，产率为1.09g/l/h，葡萄糖转化率为0.41g/g。gaba的产量以及葡萄糖转化率相较于出发菌株出现了显著提升。

30、(5)本发明构建的重组菌株cgw005在发酵培养基中分批补料发酵96h后，γ-氨基丁酸的产量达到112.03g/l，葡萄糖转化率为0.34g/g。