一种间充质干细胞的制备方法与流程

本发明涉及细胞生物学，具体涉及一种间充质干细胞的制备方法。

背景技术：

1、间充质基质干细胞（mscs）是从一些成体和围产期组织中分离出来的成体祖细胞。mscs是一种具有多向分化潜能和低免疫原性的干细胞，目前已从多种不同类型的间质组织中分离出间充质干细胞，包括骨骼肌组织，脂肪组织、脐带组织、胎盘组织、皮肤组织等。间充质干细胞能够在一些条件下进行同种异体移植，在特殊的诱导因素作用下能够分化成软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞，还可以转化成其他胚层来源的不同类型的细胞，包括胰岛细胞、上皮细胞、心肌细胞等。间充质干细胞在移植时的致癌可能性比较低，在临床应用中更加安全。

2、经血源性间充质干细胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells，menscs）是一种新型的间质细胞，是从女性月经血中分离的子宫内膜间充质干细胞。menscs除了具有与其他间质细胞具有相同的特征，如为塑料贴壁细胞，表达典型间充质间质细胞表面标记物，在体外能够分化为中胚层细胞系，显示低免疫原性谱等，menscs还具有较高的提取效率、较强的体外传代能力和极低的免疫原性。与骨髓和脂肪来源的间充质干细胞相比，menscs从月经血中提取，样本获取过程中避免了有创操作和感染风险。与脐带和胎盘来源的间充质干细胞相比，menscs能够实现自体回输移植，因此在再生医学领域具有较大的研究潜力和临床转化价值。menscs无论是作为治疗药物本身或是治疗载体均比传统msc更具优势，被越来越多的研究者所关注。

3、中国专利cn104711220a中公开了一种新型的制备经血间充质干细胞的方法，所述方法包括：a.体外收集经血，并保存在经血采集液中，得到经血混合液；b.从经血混合液分离单个核细胞；c.贴壁培养上述单个核细胞，使之细胞扩增，随后通过贴壁纯化，得到经纯化的细胞，即经血间充质干细胞。所述的经血采集液为每100ml hank's平衡盐溶液中，含有以下成分：万古霉素80μg/ml、头孢氨苄300μg/ml、卡那霉素120μg/ml、庆大霉素150μg/ml、两性霉素b 3μg/ml及450单位肝素，且所述经血采集液还含有0.5-1.0mm的丝氨酸蛋白酶抑制剂aebsf和低于0.8mm的半胱氨酸蛋白酶抑制剂e-64以及0.3-0.75mm金属蛋白酶抑制剂edta。该发明具有下述优点：对供体无损害、均一性强，细胞活力高，这体现在细胞扩增速度快，传代次数高等特点。但该发明中所使用的培养基中包含胎牛血清，输入人体可能会产生不良反应。

4、目前对于经血源间充质干细胞的制备处于初期的研究阶段，但由于menscs的各项优势，提供一种表型稳定、安全性高、细胞衰老慢的menscs的制备方法对其临床应用具有重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种经血源间充质干细胞的制备方法，制备得到的经血来源的间充质干细胞的干性保持较好，且表型稳定，多次传代后，仍能保持未衰老现象，安全性好。

2、为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

3、一方面，本发明提供了一种经血源间充质干细胞的制备方法，包括：将采集的经血进行预处理，加入无血清培养基放入培养箱中进行培养，得到间充质干细胞；

4、所述的无血清培养基包括基础培养基和添加组分a和添加组分b，所述的添加组分a包括依拉瑞肽（elamipretide tfa，mtp-131）和曲美他嗪；

5、所述的依拉瑞肽以依拉瑞肽溶液的形式添加到基础培养基中，按照体积分数计，所述的依拉瑞肽溶液为基础培养基的0.1-5%，所述的依拉瑞肽溶液的浓度为100mm；

6、所述的曲美他嗪以曲美他嗪溶液的形式添加到基础培养基中，按照体积分数计，所述的曲美他嗪溶液为基础培养基的0.1-5%，所述的曲美他嗪的质量体积浓度为6%。

7、进一步优选地，按照体积分数计，所述的依拉瑞肽溶液为基础培养基的0.1%，所述的曲美他嗪溶液为基础培养基的0.1%。

8、优选地，所述的添加组分b包括人血小板裂解物（platelet-rich plasma, prp）。

9、进一步优选地，按照体积分数计，所述的人血小板裂解物为基础培养基的5-20%。

10、再进一步优选地，按照体积分数计，所述的人血小板裂解物为基础培养基的5%。

11、优选地，所述的添加组分a先与基础培养基混匀，再加入添加组分b。

12、优选地，所述的基础培养基选自mem-α基础培养基、dmem培养基、dmem/f12培养基中的一种或多种。

13、进一步优选地，所述的基础培养基为mem-α基础培养基。

14、优选地，所述的经血的预处理包括以下步骤：

15、（1）将经血用缓冲液进行等体积稀释，添加青霉素-链霉素和两性霉素b；

16、（2）过滤，进行匀浆处理；

17、（3）加入淋巴细胞分离液，分离单个核细胞；

18、（4）离心，弃上清，吸取中间白膜层，加入缓冲液重悬，离心，弃上清；

19、（5）加入培养基，重悬细胞，调整细胞浓度，接种至培养瓶中，培养；

20、（6）待细胞生长接近融合80-90%时，用胰酶消化贴壁细胞，离心进行传代培养。

21、具体地，步骤（1）中所述的缓冲液为pbs缓冲液。

22、优选地，步骤（1）中加入的青霉素-链霉素和两性霉素b的浓度为1%。

23、具体地，所述的青霉素-链霉素和两性霉素b的浓度为1%是指将青霉素-链霉素溶液和两性霉素溶液按照100倍进行稀释。

24、具体地，步骤（2）中所述的过滤为使用100目筛网过滤，以去除子宫内膜组织的存在。

25、优选地，步骤（3）中淋巴细胞分离液与经血的体积比为1:1。

26、优选地，步骤（4）中离心的转速为2000r/min，离心的时间为15min。

27、优选地，步骤（4）中所述的缓冲液为pbs缓冲液。

28、优选地，步骤（5）中接种为以1×105个/ml接种至培养瓶中。

29、优选地，步骤（5）中培养的条件为在37℃、5%co2条件下培养。

30、优选地，步骤（6）中所述的胰酶为0.25%胰蛋白酶-0.02%edta。

31、优选地，步骤（6）中培养的条件为在37℃、5%co2条件下培养。

32、根据本发明的一些实施方式，所述的经血源间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

33、（1）将采集的经血以pbs缓冲液等体积稀释，加入1%青霉素-链霉素和两性霉素b，过滤，匀浆；

34、（2）按照1:1的体积比加入淋巴细胞分离液，分离单个核细胞，2000 r/min 转速离心15 min，弃上清；

35、（3）吸取中间白膜层，两倍体积加入缓冲液重悬离心，1500 r/min，6 min洗涤2次；

36、（4）加入培养基，以1×105个/ml接种至培养瓶中在37℃、5%co2培养箱中培养，待细胞生长接近融合（长至80-90%）时，用0.25%胰蛋白酶-0.02%edta轻轻消化贴壁细胞，终止消化，1200 r/min离心5分钟；

37、（5）传至第3代，按5000-10000个/cm2的密度接种于培养瓶中，加入无血清培养基，放入37℃，5%co2的培养箱中培养，得间充质干细胞。

38、又一方面，本发明提供了上述的制备方法制备得到的经血源间充质干细胞。

39、又一方面，本发明提供了上述的制备方法制备得到的经血源间充质干细胞或上述的经血源间充质干细胞在制备治疗炎症、糖尿病、神经系统疾病的药物中的应用。

40、本发明所述，依拉瑞肽是一个心磷脂过氧化物酶抑制剂和线粒体靶向的肽。依拉瑞肽减轻人小梁网细胞中的线粒体功能障碍和氧化损伤。依拉瑞肽可以阻止ihtm和gtm(3)细胞由h2o2诱导的持续氧化应激。曲美他嗪能保护间充质干细胞免受过氧化氢诱导的伤害，通过保护细胞在缺氧或缺血情况下的能量代谢，阻止细胞内atp水平的下降。

41、本发明的有益效果为：

42、1、本发明将依拉瑞肽和曲美他嗪加入于无血清培养基，促进经血源间充质干细胞较快贴壁，可以长期保持经血来源的间充质干细胞增殖，数量多。

43、2、本发明提供的间充质干细胞的制备方法制备得到的间充质干细胞的干性保持较好，且表型稳定。

44、3、多次传代后，仍能保持未衰老现象。

45、4、本发明的培养基中不使用胎牛血清，prp来源于人类，输注人体不会引起异种蛋白免疫反应，解决了传统培养使用胎牛血清培养细胞的方法缺陷。