与水稻纹枯病抗性相关的SNP分子标记、KASP引物组、试剂盒及应用

本发明涉及snp分子标记以及检测引物，尤其涉及与水稻纹枯病抗性相关的snp分子标记、kasp检测引物组及其在鉴定水稻对纹枯病抗性中的应用，属于与水稻纹枯病抗性相关的snp分子标记及其应用领域。

背景技术：

1、由立枯丝核菌(rhizoctonia solani kuhn)引起的纹枯病是全球稻作栽培中一种重要的真菌性病害，对水稻产量和品质造成重大影响，普遍发生于亚、非、欧、美各洲水稻种植国家。一般年份可导致水稻减产10％-30％，严重时减产可达50％。长期以来，对纹枯病的防治主要依赖于化学药剂和栽培措施，选育和种植抗病品种是防治纹枯病的有效手段。开发检测水稻纹枯病抗性的分子标记，对于筛选抗纹枯病的水稻种质资源以及在育种过程中快速鉴定抗纹枯病植株的研究中具有重要的应用价值。

2、kasp(kompetitive allele-specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，可用于检测snp位点和indel位点。与ssr、rflp、indel等分子标记相比，kasp标记具有检测快速，成本低，易于规模化应用等特点。kasp标记不需要根据dna片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳检测方法的步骤相对繁琐，低通量的缺点，适用于高通量分子检测平台。因此，鉴定与水稻纹枯病抗性相关的功能snp位点，开发适合于高通量分子检测平台的水稻纹枯病抗性kasp分子标记对于提高水稻的育种效率和育种水平将具有重要应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供与水稻对纹枯病抗性相关的snp分子标记；

2、本发明的目的之二是提供检测所述与水稻对纹枯病抗性相关的snp分子标记的kasp引物组；

3、本发明的目的之三是提供含有所述kasp引物组的检测试剂盒；

4、本发明的目的之四将所述的snp分子标记或kasp检测引物组或含有所述kasp引物组的检测试剂盒应用于鉴定或辅助鉴定或者水稻对纹枯病抗性、或者用于选育具有纹枯病抗性的水稻品种或感纹枯病的水稻品种。

5、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

6、本发明的一方面提供了与水稻对纹枯病抗性相关的snp分子标记(snp-33287194)，以日本晴基因组序列为参考基因组，该snp分子标记位于3号染色体33287194bp位点处，该snp位点处及其附近的核苷酸序列为seq id no.4所示；其中，seq id no.4所示的核苷酸序列中的第24位核苷酸为snp位点，为t/c多态，所述基因型为tt或cc，所述tt是所述snp位点为t的纯合型，所述snp的基因型为tt的待测水稻为或候选为抗纹枯病的水稻；所述cc是所述snp位点为c的纯合型，所述snp的基因型为cc的待测水稻为或候选为感纹枯病的水稻；snp位点基因型为tt的水稻品种的纹枯病抗性高于该snp位点基因型为cc的水稻品种。

7、本发明可以通过本领域技术人员所知晓的各种检测方法、检测仪器或试剂检测与水稻对纹枯病抗性相关的snp分子标记(snp-33287194)位点的多态性或基因型，包括但不限于：dna测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、snp芯片、各种pcr检测试剂盒(包括kasp检测试剂盒)；其中，snp芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白dna结合反应的芯片及基于荧光分子dna结合反应的芯片。

8、本发明还可将检测所述snp位点多态性和基因型的物质与其他物质(如检测其他与水稻抗纹枯相关的分子标记的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备鉴定水稻抗纹枯品种产品。

9、本发明的另一方面是提供了检测所述与水稻对纹枯病抗性相关的snp分子标记的kasp引物组，所述kasp引物组可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(dig)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

10、作为本发明的一种优选的具体实施方案，本发明提供了一组检测所述与水稻对纹枯病抗性相关的snp分子标记的kasp引物组，所述的kasp引物组由两条上游引物a和引物b以及一条下游引物c组成；其中，所述的上游引物a的核苷酸序列为seq id no.1所示的核苷酸序列或为seq idno.1所示的核苷酸序列中第22-41位的单链dna，seq id no.1所示的核苷酸由44个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为fam序列(作为标记物)，第22-41位核苷酸为特异序列；

11、所述的上游引物b的核苷酸序列为seq id no.2所示或为seq id no.2所示的核苷酸序列中第22-42位的单链dna，seq id no.2所示的核苷酸由42个核苷酸组成，第1-21位核苷酸为hex序列(作为标记物)，第22-42位核苷酸为特异序列。

12、所述的下游引物c的核苷酸序列为seq id no.3所示；所述的上游引物a为5’端带有fam荧光标签序列，用酶标仪或荧光定量pcr仪可读取到fam基团的荧光信号。

13、本发明的再一方面是提供了鉴定或辅助鉴定水稻纹枯病抗性的检测试剂盒，包括：kasp引物组，特异探针组和kasp higeno 2x probe mix；其中，所述的kasp引物组由两条上游引物a和引物b以及一条下游引物c组成；其中，所述的上游引物a的核苷酸序列为seqid no.1所示的核苷酸序列或为seq id no.1所示的核苷酸序列中第22-41位的单链dna，所述的上游引物b的核苷酸序列为seq id no.2所示或为seq id no.2所示的核苷酸序列中第22-42位的单链dna，所述的下游引物c的核苷酸序列分别为seq id no.3所示。

14、所述特异探针组包括荧光探针a、淬灭探针a、荧光探针b和淬灭探针b；所述荧光探针a的核苷酸序列为seq id no.5所示，5’末端连接荧光基团，优选为fam荧光基团；所述荧光探针b的核苷酸序列为seq id no.6所示，5’末端连接荧光基团，优选为hex荧光基团；淬灭探针a的核苷酸序列为seq id no.7所示，3’末端连接淬灭基团，优选为bhq基因；淬灭探针b的核苷酸序列为seq id no.8所示，3’末端连接淬灭基团，优选为bhq基团。

15、所述的kasp higeno 2x probe mix含有高保真taq酶、dntp、mg2+等，可从商业途径购买得到(北京嘉程生物科技有限公司产品(货号aqp-001s))。

16、本发明的另一方面是提供一种鉴定或辅助鉴定水稻纹枯病抗性的方法，包括：

17、(1)提取待检测水稻样品的基因组dna；

18、(2)以与水稻对纹枯病抗性相关的snp分子标记(snp-33287194)为检测靶标设计kasp引物组建立pcr扩增体系并进行pcr扩增；

19、(3)荧光检测扩增产物，确定待检测水稻样品的所述snp分子标记(snp-33287194)的基因型；如果待检测水稻样品的所述snp分子标记的基因型为tt，则检测水稻样品为或候选为抗纹枯病的水稻；如果待检测水稻样品的所述snp分子标记的基因型为cc，则检测水稻样品为或候选为感纹枯病的水稻；

20、本发明进一步提供了一种选育具有纹枯病抗性的水稻品种的方法，包括：

21、(1)提取待检测水稻样品的基因组dna；

22、(2)以与水稻对纹枯病抗性相关的snp分子标记(snp-33287194)为检测靶标设计kasp引物组建立pcr扩增体系并进行pcr扩增；

23、(3)荧光检测扩增产物，确定待检测水稻样品的所述snp分子标记(snp-33287194)的基因型；如果待检测水稻样品的所述snp分子标记的基因型为tt，则检测水稻样品为或候选为具有纹枯病抗性的水稻品种。

24、本发明进一步提供了一种选育感纹枯病的水稻品种的方法，包括：

25、(1)提取待检测水稻样品的基因组dna；

26、(2)以与水稻对纹枯病抗性相关的snp分子标记(snp-33287194)为检测靶标设计kasp引物组建立pcr扩增体系并进行pcr扩增；

27、(3)荧光检测扩增产物，确定待检测水稻样品的所述snp分子标记(snp-33287194)的基因型；如果待检测水稻样品的所述snp分子标记的基因型为cc，则检测水稻样品为或候选为感纹枯病的水稻品种。

28、作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(2)所建立的pcr扩增体系为：待检测水稻样品的基因组dna模板溶液2μl、kasp引物组工作液0.14μl、kasp higeno 2x probemix 5μl、无菌超纯水2.86μl。

29、作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(2)所述的pcr扩增的程序为：

30、第一步：95℃预变性10min；

31、第二步：95℃20s、61℃40s，95℃20s、60.4℃40s，95℃20s、59.8℃40s，95℃20s、59.2℃40s，95℃20s、58.6℃40s，95℃20s、58℃40s，95℃20s、57.4℃40s，95℃20s、56.8℃40s，95℃20s、56.2℃40s，95℃20s、61℃40s，95℃20s、55.6℃40s；

32、第三步：95℃变性20s、55℃退火40s，40个循环。

33、作为本发明的一种优选的具体实施方案，步骤(3)确定待检测水稻样品的所述snp分子标记(snp-33287194)的基因型的方法为：在qx400实时荧光定量pcr仪进行荧光读板，温度为37℃，保持60s，采用终末端读取荧光值进行基因分型。

34、本发明中所述的待检测水稻样品具体可为如下水稻材料中的任意一种：auspaddy(red)::irgc 44978-1、laraboro::irgc 79342-1、aus 295::irgc 29083-1、aus299::irgc 29087-1、arc 12067::irgc 21881-1、aus 329::irgc 29116-1、lal moti::irgc 82168-1、devarasi::irgc 16173-1、aus171::irgc 29004-1、aus 308::irgc 29096-1、mansara dhan::irgc 86940-1、kurulu wee(white)::irgc 66518-1、zarbasail::irgc37346-1、arc 12101::irgc 21907-1、begmi 135::irgc 27845-1、madisa::irgc 27568-1、m 142::irgc 35054-1、arc 14901::irgc 41811-1、bari sutar::irgc 52410-1、koyra::irgc 77267-1、lal taura::irgc 35017-1、jhul diga::irgc 26478-1、uprh 58::irgc61525-1、aus 439::irgc 29221-1、dangar::irgc 76296-1、motia::irgc 28036-1、shittaaman::irgc 37596-1、ct 58::gervex 1491-c1、polizesti 28::gervex 1170-c1、jubilieni::gervex 992-c1、sant andrea::irgc 65732-1、rpc 12::gervex 1505-c1、seln 244a6-20::gervex 1273-c1、gongchengxiang、thaiperla::gervex 696-c1、sanghai::gervex 1264-c1、ct 23::gervex 1488-c1、s102::gervex 1671-c1、sr 113::gervex 553-c1、kulon::gervex 1473-c1、settantuno::gervex 1279-c1、cigalon::gervex 1514-c1、delta::gervex 1519-c1、68-2::irgc 14546-1、escarlate::gervex887-c1、qiutianxiaoting、plovdiv 22::gervex 1167-c1、t 757::gervex1316-c1、augusto::gervex 1643-c1、melas::gervex 1684-c1、rocca::irgc 50351-1、capataz::gervex 521-c1、m 203::irgc 76309-1、mejanes2::gervex 1560-c1。

35、此外，以上所述待检测水稻样品为以如下水稻材料中的任意一种或两种为亲本得到的后代：aus paddy(red)::irgc 44978-1、laraboro::irgc 79342-1、aus295::irgc29083-1、aus299::irgc 29087-1、arc 12067::irgc 21881-1、aus 329::irgc 29116-1、lal moti::irgc 82168-1、devarasi::irgc 16173-1、aus171::irgc 29004-1、aus 308::irgc 29096-1、mansaradhan::irgc 86940-1、kurulu wee(white)::irgc 66518-1、zarbasail::irgc 37346-1、arc 12101::irgc 21907-1、begmi 135::irgc 27845-1、madisa::irgc 27568-1、m 142::irgc 35054-1、arc 14901::irgc 41811-1、bari sutar::irgc 52410-1、koyra::irgc 77267-1、lal taura::irgc 35017-1、jhul diga::irgc26478-1、uprh 58::irgc 61525-1、aus 439::irgc 29221-1、dangar::irgc 76296-1、motia::irgc 28036-1、shittaaman::irgc 37596-1、ct 58::gervex 1491-c1、polizesti28::gervex 1170-c1、jubilieni::gervex 992-c1、sant andrea::irgc 65732-1、rpc12::gervex 1505-c1、seln 244a6-20::gervex 1273-c1、gongchengxiang、thaiperla::gervex 696-c1、sanghai::gervex 1264-c1、ct 23::gervex 1488-c1、s102::gervex1671-c1、sr 113::gervex 553-c1、kulon::gervex 1473-c1、settantuno::gervex 1279-c1、cigalon::gervex 1514-c1、delta::gervex 1519-c1、68-2::irgc 14546-1、escarlate::gervex 887-c1、qiutianxiaoting、plovdiv 22::gervex 1167-c1、t 757::gervex 1316-c1、augusto::gervex 1643-c1、melas::gervex 1684-c1、rocca::irgc50351-1、capataz::gervex 521-c1、m 203::irgc 76309-1、mejanes2::gervex 1560-c1。

36、本发明提供了与水稻对纹枯病抗性相关的snp分子标记(snp-33287194)并设计了检测该snp分子标记的kasp引物组以及含有该kasp引物组的鉴定或辅助鉴定水稻纹枯病抗性的检测试剂盒。采用本发明提供的kasp引物组或含有该kasp引物组的检测试剂盒可用于预测水稻对纹枯病的抗性，可以对待筛选水稻进行早期筛选，可用于水稻分子标记辅助育种，在发掘抗纹枯病水稻种质资源和选育抗纹枯病水稻品种的研究中具有重要的应用价值。

37、本发明涉及缩略语和关键术语定义

38、本发明中所述纹枯病可为由rh9或其他菌株引起的纹枯病。

39、本发明中抗纹枯病的水稻可为抗病性试验中相对病斑高度小于等于40％的水稻。

40、本发明中感纹枯病的水稻可为抗病性试验中相对病斑高度大于等于75％的水稻。

41、snp：单核苷酸多态性。

42、kasp：竞争性等位基因特异性pcr。