一种培育富含黄酮醇番茄的方法及其在提高果实耐贮性中的应用

本发明涉及基因工程、分子生物学及生理学等领域，具体地说，涉及一种培育富含黄酮醇番茄的方法及其在提高果实耐贮性中的应用。

背景技术：

1、园艺产品采后贮藏过程中会出现多种生理机能下降、易受病原菌侵染等现象，严重影响采后园艺产品的经济价值，限制其市场流通。多数研究表明，活性氧的积累和其诱导的氧化损伤，是影响果实采后货架期的关键因素之一；同时采后病原菌的侵染也是导致果实品质劣变、限制其采后贮藏的重要因素。

2、灰葡萄孢(botrytis cinerea)，是第二大重要的真菌病原体，对葡萄、草莓和番茄等具有重要经济价值的园艺作物具有毁灭性的影响。据统计，灰霉病每年在世界范围内可造成100亿到1000亿美元的经济损失。迄今为止，控制灰霉病的主要方法仍然是施用合成杀菌剂，但由于其对人类和环境的潜在风险以及病原体的抗药性，这些方法的效果有限。因此，应用绿色、健康的方法来延长园艺产品采后货架对于园艺产品市场价值的提升具有重要意义。

3、黄酮醇是类黄酮化合物中的一类，广泛存在于植物根、茎、叶、花、果实和种子中。黄酮醇对植物生长发育和抵抗逆境等发挥着重要作用，包括调控生长素转运、促进侧根形成、影响花粉发育、抗紫外线、调节叶片气孔开度等。另外，黄酮醇是植物中众所周知的自由基清除剂，其具有较强的抗氧化能力，在多种人类疾病预防与治疗、植物生长发育调节中起着重要的作用。然而，关于黄酮醇是否影响果实的采后贮藏及灰霉病抗性的信息仍然有限。

4、目前黄酮醇生物合成路径已基本明晰，同时代谢调控因子如r2r3-myb型转录因子参与调控黄酮醇生物合成的作用也有较多报道。利用代谢物的生物合成途径及其调控机制，来实现特定代谢途径的强化和代谢流的定向引导是植物代谢工程的重要手段。但是，有关黄酮醇生物合成基因及转录调控因子的定向代谢强化的研究鲜有报道。

5、番茄原产地为南美洲热带地区，是世界上栽培最广泛的蔬菜作物之一，也是我国栽培面积最大的设施蔬菜作物。番茄果实富含类黄酮化合物，而且是研究果实性状最重要的模式植物，因其生长周期短、基因组完整公开等优势而被广泛应用于代谢工程和种质创新。因此，利用植物代谢工程，定向培育黄酮醇显著积累的番茄种质对于增强果实耐贮性具有重要意义。

6、通过过表达杨梅mrmyb12/mrf3’5’h基因，提高番茄番茄黄酮醇含量，进而增强果实的耐贮性，创造具有更高市场价值的番茄种质，为进一步了解黄酮醇的采后应用提供重要参考，对于园艺作物品质性状的改善具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明实施例提供一种培育富含黄酮醇番茄的方法及其在提高果实耐贮性中的应用。通过基因过表达技术使得所述杨梅mrmyb12基因和mrf3’5’h基因的表达水平上升；所述杨梅mrmyb12基因和mrf3’5’h基因的核苷酸序列如seq:no.1和seq:no.2所示。

2、本实例中杨梅mrmyb12基因为以下1)-4)中的任意一种核苷酸序列：

3、1)seq:no.1所示的核苷酸序列；

4、2)seq:no.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有不改变原核苷酸序列功能的核苷酸序列；

5、3)在严格条件下与seq:no.1所示序列杂交获得的具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；

6、4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

7、本实例中杨梅mrf3’5’h基因为以下1)-4)中的任意一种核苷酸序列：

8、1)seq:no.2所示的核苷酸序列；

9、2)seq:no.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有不改变原核苷酸序列功能的核苷酸序列；

10、3)在严格条件下与seq:no.2所示序列杂交获得的具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1×sspe或含0.1％sds的0.1×ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；

11、4)与1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

12、为了实现本发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

13、一种培育富含黄酮醇番茄的方法及其在提高果实耐贮性中的应用，所述杨梅mrmyb12基因和mrf3’5’h基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seq:no.1和seq:no.2所示，所述应用的途径为通过过表达mrmyb12/mrf3’5’h使得番茄果实的黄酮醇含量得到提高，从而采后耐贮性得到提高。

14、进一步地，所述采后耐贮性的表征参数为采后抗氧化水平和灰葡萄孢抗性。

15、进一步地，当所述黄酮醇的含量达到3.15±0.34mg/g fw时，所述采后抗氧化水平的表征参数为总抗氧化能力和过氧化氢酶活性，所述总抗氧化能力达到60.84-117.00u，所述过氧化氢酶活性达到77.76-142.80u。

16、进一步地，当所述黄酮醇的含量达到3.15±0.34mg/g fw时，所述灰葡萄孢抗性的表征参数为病情指数和丙二醛含量，所述病情指数低至36.89％-60.89％，所述丙二醛含量低至22.50-23.39nmol/g fw。

17、进一步地，所述基因过表达技术具体如下：

18、以相应质粒为模板，分别用引物f1和r1、f2和r2、f3和r3、f4和r4对于mrmyb12蛋白编码区、camv终止子、e8启动子和mrf3’5’h蛋白编码区进行克隆扩增；利用重叠pcr技术，以上述四个扩增产物的混合产物为模板，使用引物f1和r4进行扩增，得到mrmyb12-camv-e8-mrf3’5’h双价扩增产物，将双价扩增产物构建到植物过表达载体上；所述引物f1和r1、f2和r2、f3和r3、f4和r4的核苷酸序列如seq:no.3和seq:no.4、seq:no.5和seq:no.6、seq:no.7和seq:no.8、seq:no.9和seq:no.10所示；

19、将植物过表达载体导入宿主细胞中，再利用其侵染目的植株，筛选阳性转基因植株，获得富含黄酮醇的转基因番茄。

20、进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或农杆菌细胞，所述宿主细胞优选为gv3101农杆菌细胞。

21、进一步地，所述植物表达载体为具有e8启动子的表达载体。

22、进一步地，所述表达载体为载体pcambia1301m。

23、本发明的有益效果如下：通过基因过表达技术构建番茄mrmyb12/mrf3’5’h基因过表达植株，调控所述基因mrmyb12和mrf3’5’h的表达水平来研究其对番茄果实黄酮醇含量的调控机制，结果发现，mrmyb12/mrf3’5’h过表达可以提高番茄果实中黄酮醇的含量，增强果实的耐贮性。本发明为培育耐贮性强化的新品种提供了基因资源，证明了mrmyb12/mrf3’5’h基因在提高果实黄酮醇含量和采后耐贮性中的用途，为番茄及其他园艺作物营养品质改良研究奠定了理论基础。

24、本发明首次构建了杨梅mrmyb12/mrf3’5’h基因过表达植株，并进行功能研究，发现mrmyb12/mrf3’5’h基因诱导番茄果实黄酮醇积累，增强采后耐贮性。

25、应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本技术。