一种调控稻米直链淀粉含量的基因qAC及利用基因qAC改良直链淀粉含量的方法

本发明涉及一种调控稻米直链淀粉含量的基因qac及利用基因qac改良直链淀粉含量的方法，属于植物基因工程。

背景技术：

1、水稻是世界上一半以上人口的主粮，我国是全球水稻生产和消费第一大国。近年来，随着人们生活水平的提高和稻米市场的开放，稻米作为商品进行广泛交易，人们对稻米品质也提出了越来越高的要求。而此前我国水稻育种一直以高产作为主要目标，品质改良进展相对缓慢，导致我国优质稻米品种较少。因此，在保证产量的基础上，进一步改良稻米品质是我国水稻育种的最重要目标。

2、直链淀粉与总淀粉的比值称为直链淀粉含量(amylose content，ac)，直链淀粉含量在很大程度上决定了稻米的蒸煮食味品质的优劣。直链淀粉含量过高的稻米，米质相对较差，胀性大，成饭后偏硬；而直链淀粉含量低于2％的糯米，米饭太软，弹性差；具有低直链淀粉含量(8％-12％)的软米米质介于糯性与粘性之间，米饭食味好。

3、wx基因是直链淀粉合成的关键酶基因，编码颗粒结合淀粉合成酶i(granule-bound starch synthase i，gbssi)。wx基因序列变异会引起gbssi酶活性的改变，从而影响稻米直链淀粉含量，改变米饭的柔软性。除了wx基因，du13等基因可通过直接调控wxb等位基因的前体mrna剪接，引起直链淀粉含量的变化(cai et al.,plant biotechnologyjournal 2022)。此外，为了创制不同直链淀粉含量的稻米，利用crispr/cas9基因编辑技术精准编辑wx基因编码区或上游调控区，获得了不同直链淀粉含量的水稻新种质(zeng etal.,plant biotechnology journal 2020；huang et al.,plant biotechnology journal2020)。

4、目前不同直链淀粉含量水稻种质的创制主要围绕wx基因，鉴定和克隆新的直链淀粉含量基因，将丰富水稻基因资源，为创制新的优质水稻新种质奠定基础。此前，专注水稻种子优势表达基因调控稻米品质，筛选了一批种子优势表达基因，研究其调控稻米品质的效应。其中qac6.1、qac6.2、qac9.1基因(本发明中qac基因是其统称)只在水稻籽粒灌浆期间高表达，是种子优势表达的基因，说明qac基因在种子发育过程中可能具有重要的作用。

技术实现思路

1、本发明的目的是针对上述稻米食味品质改良过程中存在的问题，提供一种调控稻米直链淀粉含量的基因qac及利用基因qac改良直链淀粉含量的方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种调控稻米直链淀粉含量的基因qac，其特征在于，所述qac基因包括qac6.1、qac6.2、qac9.1基因，其中qac6.1基因编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示，qac6.2基因编码区的核苷酸序列如seq id no.3所示，qac9.1基因编码区的核苷酸序列如seq id no.5所示。

3、所述qac6.1基因编码区的氨基酸序列如seq id no.2所示，qac6.2基因编码区的氨基酸序列如seq id no.4所示，qac9.1基因编码区的氨基酸序列如seq id no.6所示。

4、qac基因在调控稻米直链淀粉含量、改良稻米食味品质中的应用。

5、所述应用的方法如下：对水稻直链淀粉含量基因qac进行编辑，使得目标水稻品种中的qac基因表达水平的改变，进而获得具有不同稻米直链淀粉含量的水稻植株。

6、基因编辑过程中所用的重组载体pc1300-qac6.1-cas9、pc1300-qac6.2-cas9、pc1300-qac9.1-cas9，分别包含qac6.1、qac6.2、qac9.1基因；载体系统为crispr/cas9，系统中包含中间载体sk-grna和最终载体pc1300-cas9。

7、重组载体pc1300-qac6.1-cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体sk-grna用限制性内切酶aar i进行酶切后，用t4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体sk-grna-qac6.1；将测序鉴定正确的sk-grna-qac6.1中间载体利用kpn i和bgl ii进行双酶切，回收片段大小为300bp的目的片段，并与经kpn i和bamh i双酶切过的最终载体pc1300-cas9连接；

8、用于crispr/cas9系统编辑qac6.1基因的特异性靶位点序列为5’-cgctgctttcagcccggcaa-3’，所述引物序列如下：

9、 序列名称 序列 序列编号 qac6.1-cas9-f ggcacgctgctttcagcccggcaa seq id no.7 qac6.1-cas9-r aaacttgccgggctgaaagcagcg seq id no.8

10、。

11、重组载体pc1300-qac6.2-cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体sk-grna用限制性内切酶aar i进行酶切后，用t4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体sk-grna-qac6.2；将测序鉴定正确的sk-grna-qac6.2中间载体利用kpn i和bgl ii进行双酶切，回收片段大小为300bp的目的片段，并与经kpn i和bamh i双酶切过的最终载体pc1300-cas9连接；

12、用于crispr/cas9系统编辑qac6.2基因的特异性靶位点序列为5’-tggtggggcgggaggagcag-3’，所述引物序列如下：

13、 qac6.2-cas9-f ggcatggtggggcgggaggagcag seq id no.9 qac6.2-cas9-r aaacctgctcctcccgccccacca seq id no.10

14、。

15、重组载体pc1300-qac9.1-cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体sk-grna用限制性内切酶aar i进行酶切后，用t4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体sk-grna-qac9.1；将测序鉴定正确的sk-grna-qac9.1中间载体利用kpn i和bgl ii进行双酶切，回收片段大小为300bp的目的片段，并与经kpn i和bamh i双酶切过的最终载体pc1300-cas9连接；

16、用于crispr/cas9系统编辑qac9.1基因的特异性靶位点序列为5’-ggtctcgtgctcctcgtggg-3’；所述引物序列如下：

17、 qac9.1-cas9-f ggcaggtctcgtgctcctcgtggg seq id no.11 qac9.1-cas9-r aaaccccacgaggagcacgagacc seq id no.12

18、。

19、本发明方法先进科学，通过本发明，第一方面，本发明提供一种水稻qac基因，其中qac6.1基因位于水稻第6号染色体上，基因编号为os06g0141400(rap-db命名规则)，或loc_os06g04930(msu命名规则)。qac6.1基因编码区核苷酸序列全长426bp，序列如seq id no.1所示。所述qac6.1基因编码的氨基酸序列全长含有141个氨基酸，氨基酸序列如seq idno.2所示。

20、qac6.2基因位于水稻第6号染色体上，基因编号为os06g0528300(rap-db命名规则)，或loc_os06g33690(msu命名规则)。qac6.2基因编码区核苷酸序列全长621bp，序列如seq id no.3所示。所述qac6.2基因编码的氨基酸序列全长含有206个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.4所示。

21、qac9.1基因位于水稻第9号染色体上，基因编号为os09g0427800(rap-db命名规则)，或loc_os09g25890(msu命名规则)。qac9.1基因编码区核苷酸序列全长2661bp，序列如seq id no.5所示。所述qac9.1基因编码的氨基酸序列全长含有886个氨基酸，氨基酸序列如seq id no.6所示。

22、第二方面，本发明提供一种水稻qac基因在改变直链淀粉含量方面的应用。

23、所述应用的方法如下：对水稻基因qac进行编辑，使得目标水稻品种中的qac基因表达水平的改变，进而获得具有不同直链淀粉含量的水稻植株。

24、所述基因编辑过程中所用的重组载体pc1300-qac6.1-cas9、pc1300-qac6.2-cas9、pc1300-qac9.1-cas9，分别包含qac6.1、qac6.2、qac9.1基因。载体系统为crispr/cas9，系统中包含中间载体sk-grna和最终载体pc1300-cas9。

25、重组载体pc1300-qac-cas9的制备方法，所述的方法如下：将中间载体sk-grna用限制性内切酶aar i进行酶切后，用t4连接酶将其与变性退火后的目的基因互补引物进行连接，得到中间载体sk-grna-qac；将测序鉴定正确的sk-grna-qac中间载体利用kpn i和bgl ii进行双酶切，回收片段大小为300bp的目的片段，并与经kpn i和bamh i双酶切过的最终载体pc1300-cas9连接。

26、优选的，用于crispr/cas9系统编辑qac6.1基因的特异性靶位点序列为5’-cgctgctttcagcccggcaa-3’，用于crispr/cas9系统编辑qac6.2基因的特异性靶位点序列为5’-tggtggggcgggaggagcag-3’，用于crispr/cas9系统编辑qac9.1基因的特异性靶位点序列为5’-ggtctcgtgctcctcgtggg-3’。所述引物序列如下：

27、 序列名称 序列 序列编号 qac6.1-cas9-f ggcacgctgctttcagcccggcaa seq id no.7 qac6.1-cas9-r aaacttgccgggctgaaagcagcg seq id no.8 qac6.2-cas9-f ggcatggtggggcgggaggagcag seq id no.9 qac6.2-cas9-r aaacctgctcctcccgccccacca seq id no.10 qac9.1-cas9-f ggcaggtctcgtgctcctcgtggg seq id no.11 qac9.1-cas9-r aaaccccacgaggagcacgagacc seq id no.12

28、本发明具有以下效果：

29、本发明公开一种水稻qac基因及利用其改良直链淀粉含量的方法，该水稻qac基因在种子中高表达，可特异改良水稻籽粒的直链淀粉含量，而对水稻植株其他主要农艺性状无显著影响。利用基因工程技术在水稻中敲除qac基因可显著降低稻米直链淀粉含量，改良稻米蒸煮食味品质，因而qac基因在水稻的优质育种中具有很好的应用前景。