NGPVVP2单克隆抗体及其制备方法和应用

本发明涉及生物免疫，具体的，涉及ngpv vp2单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、

2、新型鸭细小病毒、番鸭细小病毒和鹅细小病毒（ngpv）同属于细小病毒亚科依赖病毒属，为单股链状dna病毒。在电镜下番鸭细小病毒和鹅细小病毒的病毒粒子分为实心和空心两种形态，直径为20~24nm，无囊膜，正二十面体对称，衣壳由32个管桩排列的壳粒构成。番鸭细小病毒和鹅细小病毒在病毒大小、形态、基因组结构等都很相似；新型鸭细小病毒与番鸭细小病毒和鹅细小病毒基因组序列差别不大，各分离株都在5.1kb左右，三者基因组都包括2个开放阅读框，左侧开放阅读框（lorf）编码非结构蛋白，右侧开放阅读框（rorf）编码结构蛋白。非结构蛋白有2个，分别为ns1和ns2，肽链长度ns1>ns2，并且共用一个终止密码子；结构蛋白有3个，分别为vp1、vp2和vp3，肽链长度vp1>vp2>vp3，也具有同一个终止密码子。非结构蛋白重要功能为参与病毒复制和转录的调节。结构蛋白vp是病毒衣壳的组成成分，番鸭细小病毒结构蛋白vp1、vp2、vp3大小分别为91、78、58 kda；新型鸭细小病毒和鹅细小病毒结构蛋白vp1、vp2、vp3蛋白大小分别为87、70、60 kda。

3、单克隆抗体是由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，其可通过杂交瘤细胞技术制备，且纯度高、成本低、特异性强、高效、无残留，可用于相应疾病预防与治疗。

技术实现思路

1、本发明提出ngpv vp2单克隆抗体及其制备方法和应用，通过表达新型鹅细小病毒vp2蛋白，制备鹅细小病毒单克隆抗体，开展单克隆抗体效果评价，利用单克隆抗体筛选出位于vp2的抗原表位，从而为鸭短喙-侏儒综合征防治提供技术支撑。

2、本发明的技术方案如下：

3、一种vp2重组基因，所述vp2重组基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。即：

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26、gtaa

27、本发明还提出了一种引物组，用于扩增得到所述vp2重组基因，包括正向引物和反向引物，

28、所述正向引物为5'-cgcggatccatggcagagggaggaggcggagc-3'；

29、所述反向引物为5'-ccgctcgagttacagattttgagttagatatc-3'。

30、本发明还提出了一种vp2蛋白的原核表达，vp2与pet-32a上的his标签融合表达。

31、一种vp2重组蛋白，由所述的vp2重组基因编码得到，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。即：

32、tapakkntgkltdhypvvkkpklteevsagggssvvqdggataegtepvaasemaeggggamgdssggadgvgnasgnwhcdsqwmgntvitkttrtwvlpsynnhiykaitsgtsqdanvqyagystpwgyfdfnrfhchfsprdwqrlinnhwgirpkslkfkifnvqvkevttqdqtktiannltstiqvftddehqlpyvlgsategtmppfpsdvyalpqygyctmhtnqngarfndrsafycleyfpsqmlrtgnnfeftfdfeevpfhsmfahsqdldrlmnplvdqylwnfnevdsnrnaqfkkavkgaygtmgrnwlpgpkfldqrvraytggtdnyanwniwnngnkvnlkdrqyllqpgpvsathtegeassipaqnilgiakdpyrsgsttagisdimvtdeqevaptngvgwkpygrtvtneqntttaptssdldvlgalpgmvwqnrdiylqgpiwakipktdgkfhpspnlggfglhnpppqvfikntpvpadppveyvnqkwnsyitqystgqctvemvwelrkenskrwnpeiqftsnfsnrtsimfapnetggyvedrligtryltqnl。

33、本发明还提出了单克隆抗体，由所述的重组蛋白制备得到。

34、作为进一步的技术方案，所述的单克隆抗体，包括以下单克隆抗体中的至少一种：

35、命名为4b12的单克隆抗体，命名为4g6的单克隆抗体，命名为7c8的单克隆抗体。

36、作为进一步的技术方案，所述单克隆抗体的重链恒定区为igg1；轻链恒定区为kappa型。

37、作为进一步的技术方案，腹水抗体效价不低于8×106。

38、作为进一步的技术方案，gst-vp2为更换表达载体及融合表达的标签并用于所述的单克隆抗体与vp2反应性的鉴定；

39、所述gst-vp2的表达载体为pgex-4t-1。

40、作为进一步的技术方案，所述反应性通过western-blot和ifa进行测定。

41、本发明还提出了单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

42、s1、以所述重组蛋白制备免疫抗原；

43、s2、使用所述免疫抗原免疫小鼠；

44、s3、融合所述小鼠的免疫脾细胞与所述小鼠的骨髓瘤细胞，获得杂交瘤细胞；

45、s4、对所述杂交瘤细胞的上清液进行特异性筛选，对上清液检测阳性的细胞进行克隆化培养，获得单克隆抗体杂交瘤细胞株；

46、s5、将所述单克隆抗体杂交瘤细胞株注射于小鼠腹腔得到单克隆抗体。

47、作为进一步的技术方案，所述重组蛋白的免疫量为50~100mg；

48、所述单克隆抗体杂交瘤细胞株的接种量为106。

49、本发明还提出了所述的单克隆抗体或所述制备方法制备得到的单克隆抗体在ngpv抗原表位鉴定上的应用。

50、作为进一步的技术方案，所述单克隆抗体或所述制备方法制备得到的单克隆抗体应用于ngpv抗原表位的鉴定，确定的表位序列为：

51、4b12："38dggatae44"；

52、4g6："546wnpeiqf552"；

53、7c8："461rdiylqgpiwak472"。

54、作为进一步的技术方案，所述ngpv抗原表位鉴定的截短肽的表达载体为pgex-4t-1。

55、本发明的工作原理及有益效果为：

56、1、本发明提供了一种引物组，并构建了一种vp2蛋白表达载体，通过表达新型鹅细小病毒vp2蛋白，制备鹅细小病毒单克隆抗体，开展单克隆抗体效果评价，利用单克隆抗体筛选出位于vp2的抗原表位，从而为鸭短喙-侏儒综合征防治提供技术支撑。

57、2、本发明中单克隆抗体的重链型为：igg1，轻链型为：kappa型，腹水抗体效价不低于8×106，具有较强的特异性，成本低，操作简便快速，显示检测结果直观准确，不依赖于大型仪器，易于在科研和临床诊断中广泛应用推广。该单克隆抗体可用于探测、诊断、预防和治疗水禽细小病毒，特别是新型鹅细小病毒。