一种在优质水稻越光中缩短抽穗期的改良方法与流程

本发明属于水稻育种，具体涉及一种利用基因编辑方法缩短优质水稻越光抽穗期的改良方法。

背景技术：

1、越光是日本1950-1960年代育成的优质粳稻品种，几十年来一直被世界公认为顶级优质大米。但是越光品种引种到我国，适合种植的地区非常有限，在南方稻区，它的生育期急剧缩短，在东北稻区，生育期严重偏长。为了充分发挥优质品种在我国水稻生产中的价值，尤其是将越光引种到我国的优质稻米产地—黑龙江一带，必须对越光品种进行改良，缩短抽穗期，使得越光品种能在8月初之前齐穗。

2、水稻是短日照植物，只有当日照长度短于其临界日长时，水稻才能进行生殖生长进而开花。大量学者通过研究发现了hd1,ghd7和ghd8三基因在水稻抽穗期调控中的重要作用(zhang等.genetic interactions among ghd7,ghd8,osprr37 and hd1 contribute tolarge variation in heading date in rice.rice,2019,12(1):1-13)。

3、植物大多数性状受数量性状位点(quantitative trait locus，qtl)控制。水稻qtl hd4位点为ghd7，ghd7同时控制水稻的多个性状，包括抽穗期，株高和每穗粒数，是主效qtl。ghd7的cdna全长1013bp，其所编码的蛋白质由257个氨基酸组成，该蛋白质是一种核蛋白，此蛋白也是一个cct结构蛋白。ghd7有多种功能，在长日照条件下抑制抽穗，增加株高并增加穗粒数，由于其具有多效性，它在提高水稻产量和性状改良中起到重要作用(xue等.natural variation in ghd7 is an important regulator of heading date andyield potential in rice.nature genetics,2008,40(6):761-767)。

4、hd1是2000年由日本学者通过图位克隆的方法获得的qtl基因。hd1属于光周期敏感基因，其cdna全长1557bp，hd1基因包含两个外显子，hd1所编码的蛋白质含有395个氨基酸，含有锌指结构域，在拟南芥中与带有锌指结构域的co家族同源。hd1基因在不同条件下具有不同的抽穗期调节功能，近期研究发现，在珍汕97背景下，hd1无论在长短日照条件下都促进抽穗，但是当珍汕97整合ghd7后，hd1在短日照条件下抑制开花，在长日照条件下促进开花(邢永忠.ghd7、ghd8、ghd7.1和hd1共同决定水稻品种生态适应性和产量.中国作物学会学术年会摘要集.中国作物学会学术年会，河北保定，2017：9)。

5、水稻qtl的hd5位点是ghd8基因，位于第8染色体短臂上。在2006年由zhang等在珍汕97/hr5 rils发现一个qtl同时对应多个水稻性状，包括株高、抽穗期和每穗粒数。通过构建近等基因系将该位点进行了精细定位(zhang等.quantitative trait loci forpanicle,size,heading date and plant height co-segregating in trait-performance derived near-isogenic lines of rice(oryza sativa).theoretical andapplied genetics,2006,113(2):361-368)，ghd8编码含有“结合ccaat-box元件”转录因子的hap3h亚基，ghd8的cdna长度达到了1156bp，含有一个外显子，编码一个由297个氨基酸组成的多肽。ghd8一因多效，能同时控制水稻的产量、株高和抽穗期。在短日照条件下ghd8基因可促进水稻开花，在长日照条件下则可以抑制水稻开花(yan等.amajor qtl,ghd8,playspleiotropic roles in regulating grain productivity,plant height and headingdate in rice.molecular plant,2011,4(2):319-330；wei等.dth8suppresses floweringin rice,influencing plant height and yield potential simultaneously.plantphysiology,2010,153(4):1747-1758)。。

6、植物开花期受日照长度影响的特性称为感光性。刘耀光院士团队构建了具有相同遗传背景的单突变系、双突变系和三突变系的各种组合(共8个)：野生型nhld系hgd-1，单突变系(hgd-2(hd1敲除系)、hgd-3(ghd7敲除系)和hgd-4(dth8敲除系))、双突变系(hgd-5、hgd-6和hgd-7)和三突变系(hgd-8)。在研究中检测出在包括人工短日(asd)、自然短日(nsd)和人工长日(ald)三种条件下的抽穗期表型，发现hd1,ghd7和ghd8基因是水稻强光敏感性所必需的，因为这些基因中任何一个的功能丧失都会破坏这种光敏感性。无论日照长短，hd1促进开花，ghd7抑制开花。ghd7/dth8组合可以增强长日照条件下对开花期的抑制。ghd8在短日照条件下具有促进水稻抽穗的作用，在长日照条件下则会抑制水稻抽穗。hd1/ghd8,hd1/ghd7和hd1/ghd7/ghd8组合在长日照条件下对水稻开花的抑制作用逐渐增强。(zong等.strong photoperiod sensitivity is controlled by cooperation andcompetition among hd1,ghd7 and dth8 in rice heading.new phytologist.2021,229(3):1635-1649)

7、此外，通过对328份水稻核心种质资源以及49份来自国际水稻研究所的普通野生稻资源进行开花期基因ghd7,ghd8和hd1重新测序，发现了每种基因在不同的水稻品种中所含有的不同单倍型(章佳.水稻cct家族基因的功能研究和hd1的重新克隆[博士学位论文].武汉：华中农业大学，2017)。ghd7基因在野生稻中鉴定出了21种单倍型，在栽培稻中鉴定出了11种。ghd8在野生稻中鉴定出了19种单倍型，在栽培稻鉴定了11种。根据遗传效应大小，ghd7和ghd8基因的单倍型分为强功能型(s)，弱功能型(w)和无功能型(n)三种类型。hd1在野生稻中一共鉴定到20种单倍型，在栽培稻中鉴定到29种，而hd1的单倍型只能区分为功能型(f)和无功能型(n)两种类型。研究发现ghd7,ghd8和hd1基因组合很大程度上决定了水稻的抽穗期，这三种基因型的不同组合为水稻适应不同纬度地区的种植提供可能。ghd7强功能单倍型主要分布于中国华中、华南部及西南部地区，弱功能单倍型广泛分布于各地，无功能单倍型主要分布于东北地区和双季稻区的早稻中。ghd8强功能单倍型主要分布在中低纬度地区，弱功能单倍型广泛分布多纬度地区(包括北方高纬度地区)，无功能的单倍型也广泛分布于多纬度地区。hd1有功能的单倍型主要分布于中低纬度地区，无功能的单倍型广泛分布于各个纬度地区。

8、在此基础上，对hd1,ghd7和ghd8三个基因的组合进行分类，并对其地理分布特征进行了对比分析(周想春.基于基因编辑的水稻抽穗期定向改良及广亲和材料创建[博士学位论文].武汉：华中农业大学，2017)。通过对100份水稻品种三个基因组合的分析发现，nnf(ghd7和ghd8为非功能型等位基因，hd1为功能型等位基因)、ssf和ssn(ghd7和ghd8的强等位基因，hd1分别为功能型或非功能型)组合主要在中国中部和南部种植的籼稻中检测到。而来自黑龙江的粳稻品种组合nwn(ghd7和hd1为无功能型等位基因，ghd8为弱功能型等位基因)抽穗期60天，单株产量为10.5克。因此，分析结果表明，三基因nwn组合生长期较短，适合于东北地区，尤其是黑龙江一带。

9、本发明对越光品种ghd7,ghd8和hd1三基因的等位基因进行测序，得到影响越光抽穗期基因的序列；其中，越光的ghd7序列(序列1)与ghd7中的hap4单倍型一致，功能为弱功能型；越光ghd8序列(序列2)与ghd8中的hap2单倍型一致，功能为弱功能型；越光hd1序列(序列3)与hd1的hap6单倍型一致，功能为有功能型，即wwf类型。基因编辑技术为实现对越光品种影响开花期ghd7，ghd8和hd1三基因从wwf转变为的nwn组合，获得抽穗期提前的优质越光水稻品种提供了可能。

技术实现思路

1、为适应黑龙江地区的日照和气候环境，改变特优水稻越光的抽穗期，实现影响水稻越光开花期ghd7，ghd8和hd1三基因的nwn组合，本发明提出了一种缩短抽穗期的改良新方法，首先对越光水稻进行测序，得到抽穗期基因序列，然后利用crispr/cas9基因组编辑技术定向敲除ghd7和hd1基因，获得ghd7,ghd8和hd1三基因的nwn倍型组合，实现越光水稻抽穗期的调控，缩短越光的抽穗期，从而获得可以引种至我国东北黑龙江地区的越光水稻优质品种。本发明所采用的技术方案具体如下：

2、一种在优质水稻越光中缩短抽穗期的改良方法，该方法具体步骤如下：

3、(1)构建ghd7-hd1敲除材料的crispr/cas9载体

4、为了构建ghd7-hd1敲除材料的crispr/cas9载体，每个基因设计2个敲除靶点，靶点位于基因的编码区；其中，ghd7靶点一序列如序列4所示；ghd7靶点二序列如序列5所示；hd1靶点一序列如序列6所示；hd1靶点二序列如序列7所示；

5、通过pcr扩增上述靶点序列，分别选择osu6a和osu6b启动子驱动的表达盒，再通过golden gate的克隆方法将表达盒连接到双元载体pylcrispr/cas9pubi-h中；

6、之后将重组质粒转化大肠杆菌，经过阳性克隆的筛选与测序，测序结果无误的克隆即为对应基因的crispr/cas9载体。把重组质粒导入土壤农杆菌，首先用ca2+处理农杆菌，使农杆菌转变为感受态；然后将重组质粒和感受态细胞在缓冲液中混合培养，使农杆菌吸收大肠杆菌中的质粒完成转化过程。

7、(3)植物愈伤组织培养

8、选取当年收取的水稻种子，去壳。准备100ml小锥形瓶若干，配制水稻诱导培养基，高温灭菌。去壳种子放置于75％酒精中浸泡2-3min，再放置到升汞溶液中浸泡18min，消毒。将灭菌的种子平铺到诱导培养基上，保持25℃左右温度暗培养40-60天。

9、(4)转染、筛选及分化

10、将保存在-80℃的农杆菌菌种解冻，在lb培养基上画线培养。大约培养48小时后，在培养基上出现肉眼可见的乳白色光滑菌落时，可以进行农杆菌转染。用接菌环将农杆菌刮到悬浮培养基上，振摇20-30min后，待菌液浑浊后，将愈伤组织倒入菌液中，浸泡10分钟。晾干后放置到20℃恒温培养箱中暗培养48小时。

11、第一次筛选，先用灭菌水将被农杆菌侵染后的愈伤组织清洗7-8次。洗去表面的农杆菌，晾干后继续暗培养。第二次筛选，筛选黑色坚硬的抗性愈伤组织。

12、待到抗性愈伤组织再生出黄色的新愈伤组织时，可进行分化，将新生的愈伤组织转移至分化培养基上，转移至光照培养箱培养，待到苗高约10cm左右可移栽至温室中。

13、优选地，pcr扩增的引物如下:

14、ghd7靶点一引物：正向引物grt1-g7序列如序列24所示；反向引物osu6at1-g7序列如序列25所示；

15、ghd7靶点二引物：正向引物grt6-g7序列如序列26所示；反向引物osu3t6-g7序列如序列27所示；

16、hd1靶点一引物：正向引物grt2-h1序列如序列28所示；反向引物osu6bt2-h1序列如序列29所示；

17、hd1靶点二引物：正向引物grt3-h1序列如序列30所示；反向引物osu6ct3-h1序列如序列31所示；

18、pcr扩增所使用的模板为:

19、模板u6a的序列如序列32所示；u6b的序列如序列33所示；u6c的序列如序列34所示。

20、本发明具有以下优点和效果：

21、(1)本发明通过基因编辑技术，获得ghd7，ghd8和hd1三基因的nwn倍型组合，实现越光水稻抽穗期的调控，缩短越光的抽穗期，从而获得可以引种至我国东北黑龙江地区的越光水稻优质品种；

22、(2)本发明提出的越光抽穗期改良方法，可以为创制适合多地种植的越光新品系提供支撑，也可为其它作物的性状改良提供借鉴。