一种用于扩增兔抗体可变区的成套引物对及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种用于扩增兔抗体可变区的成套引物对及其应用，特别涉及一种基于单个b细胞扩增兔抗体可变区的成套引物对及其应用。

背景技术：

1、抗体是由机体受到免疫原刺激后产生的一种具有保护作用的蛋白质，天然抗体分子一般由四条多肽链组成，各肽链之间由不同数量的链间二硫键连接。其中分子量较大的两条链被称为重链，分子量较轻的两条链被称为轻链。重链和轻链分别由氨基酸序列变化很大的可变区和相对稳定的恒定区组成。抗体在中和抗原、调理细胞吞噬、激活补体以及介导细胞毒作用方面发挥着重要作用，目前已被广泛应用于生物医学基础研究以及临床诊断治疗等许多领域。

2、由于免疫原自身有多个抗原表位，可以刺激机体产生多种b细胞，从而产生含有多种针对不同表位的抗体，被称为多克隆抗体，然而其特异性不高，易产生交叉反应，限制了其应用范围，而单克隆抗体的出现很好的解决了这些问题。1975年，分子生物学家kohler和milstein将小鼠骨髓瘤细胞和免疫后的小鼠脾细胞融合，筛选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，从而开启了单克隆抗体的时代，多种单克隆抗体制备技术也应运而生。目前应用较多的单克隆抗体制备技术包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术以及近年来发展起来的单个b细胞抗体制备技术。

3、单个b细胞抗体制备技术，首先通过流式分选技术，筛选得到表达抗原特异性抗体的单个b细胞，通过单细胞反转录聚合酶链式反应，获取轻链和重链的可变区序列，进一步构建轻重链表达载体，在真核系统中实现抗体的重组表达。该技术很好的解决了其它技术制备周期过长、噬菌体展示技术抗体轻重链不配对等问题，可以在完成免疫后1周内，得到轻重链配对的抗体序列，大大缩短了实验周期，增加了抗体制备的稳定性，目前该技术在人源和鼠源单克隆抗体制备中的应用已经较为成熟。

4、相较于常用的鼠单克隆抗体，兔单克隆抗体有着高亲和力、高特异性和低本底、可识别更多新型表位等优势。以抗体亲和力来说，兔单抗无需体外亲和力成熟这一过程，亲和力常数就可以达到10-11至10-13m，这种高亲和力使得兔单抗在开发高灵敏检测试剂以及更有效的抗体药物方面有着巨大的应用潜力。传统制备兔单抗的方法也是基于杂交瘤技术，然而由于缺少兔骨髓瘤细胞系，用异源骨髓瘤融合得到的兔-鼠杂交瘤细胞有不稳定性和不能长期分泌抗体等问题。近年来基于流式分选的兔单抗制备方法逐渐发展起来，然而目前较为流行的方法是分选后的细胞先培养7天，再进行抗体可变区的扩增，这种方法实验周期长，且对分选环境、兔单细胞培养条件提出了较高的要求。郭等人提出了一种基于rna提取和5’race技术的兔抗体可变区扩增策略，但该策略存在试剂昂贵，操作复杂，步骤繁琐的问题。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供用于扩增兔抗体可变区的成套引物对。

2、本发明提供的用于扩增兔抗体可变区的成套引物对包括用于扩增兔抗体重链可变区的第1对引物、用于扩增兔抗体重链可变区的第2对引物、用于扩增兔抗体轻链可变区的第1对引物和用于扩增兔抗体轻链可变区的第2对引物；

3、所述用于扩增兔抗体重链可变区的第1对引物由引物vh-f1和引物vh-r1组成；

4、所述用于扩增兔抗体重链可变区的第2对引物由引物vh-f2和引物vh-r2组成；

5、所述用于扩增兔抗体轻链可变区的第1对引物由引物vl-f1和引物vl-r1组成；

6、所述用于扩增兔抗体轻链可变区的第2对引物由引物vl-f2和引物vl-r2组成；

7、所述引物vh-f1为序列表中序列1所示的单链dna分子；

8、所述引物vh-r1为序列表中序列2所示的单链dna分子；

9、所述引物vh-f2为序列表中序列3所示的单链dna分子；

10、所述引物vh-r2为序列表中序列4所示的单链dna分子；

11、所述引物vl-f1为序列表中序列5所示的单链dna分子；

12、所述引物vl-r1为序列表中序列6所示的单链dna分子；

13、所述引物vl-f2为序列表中序列7所示的单链dna分子；

14、所述引物vl-r2为序列表中序列8所示的单链dna分子。

15、在本发明的一个实施方案中，所述用于扩增兔抗体重链可变区的第1对引物中的引物vh-f1和引物vh-r1的摩尔比为1:1，所述用于扩增兔抗体重链可变区的第2对引物中的引物vh-f2和引物vh-r2的摩尔比为1:1；所述用于扩增兔抗体轻链可变区的第1对引物中的引物vl-f1和引物vl-r1的摩尔比为1:1；所述用于扩增兔抗体轻链可变区的第2对引物中的引物vl-f2和引物vl-r2的摩尔比为1:1。

16、本发明的另一个目的是提供上述成套引物对的新用途。

17、本发明提供了上述成套引物对在如下b1)-b5)任一种中的应用：

18、b1)扩增兔抗体可变区；

19、b2)制备扩增兔抗体可变区的产品；

20、b3)获得兔抗体可变区序列；

21、b4)制备获得兔抗体可变区序列的产品；

22、b5)制备兔抗体。

23、本发明还有一个目的是提供含有上述成套引物对的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下c1)-c3)中任一种：

24、c1)扩增兔抗体可变区；

25、c2)获得兔抗体可变区序列；

26、c3)制备兔抗体。

27、本发明还有一个目的是提供上述试剂盒的制备方法。

28、本发明提供的上述试剂盒的制备方法为如下d1)或d2)：

29、d1)将上述各对引物中的引物分别单独包装；

30、d2)将上述各对引物中的引物按比例混合包装。

31、本发明的最后一个目的是提供一种扩增兔抗体可变区的方法。

32、本发明提供的扩增兔抗体可变区的方法包括如下步骤：

33、1)以cdna为模板，采用上述引物vh-f1和引物vh-r1进行重链第一轮pcr扩增，得到重链第一轮pcr产物，采用上述引物vl-f1和引物vl-r1进行轻链第一轮pcr扩增，得到轻链第一轮pcr产物；所述cdna来源于表达抗原特异性抗体的单个b细胞；

34、2)以所述重链第一轮pcr产物为模板，采用上述引物vh-f2和引物vh-r2进行重链第二轮pcr扩增，得到重链第二轮pcr产物；

35、以所述轻链第一轮pcr产物为模板，采用上述引物vl-f2和引物vl-r2进行轻链第二轮pcr扩增，得到轻链第二轮pcr产物；

36、3)对所述重链第二轮pcr产物和所述轻链第二轮pcr产物进行测序，得到兔抗体可变区序列。

37、上述1)所述的方法中，所述表达抗原特异性抗体的单个b细胞可按照如下方法进行制备：

38、1-1)用免疫原对兔子进行免疫，免疫后取外周血分离单个核细胞，得到外周血单个核细胞；

39、1-2)采用荧光素偶联抗体标记所述外周血单个核细胞，经流式分选得到表达抗原特异性抗体的单个b细胞。

40、在本发明的一个实施方案中，所述免疫原可为本技术领域常用的各种抗原，在本发明中免疫原的选择不受限制，可根据具体的实验目的进行选择。所述免疫原可以通过商业途径购买获得，也可以自行制备获得。

41、在本发明的一个具体实施方案中，所述免疫原为a型肉毒毒素hc片段，其可与神经元受体结合，常用于制备a型肉毒毒素抗体。所述a型肉毒毒素hc片段的具体制备方法可包括如下步骤：a1)将a型肉毒毒素hc片段表达载体转化宿主菌，得到重组菌；所述a型肉毒毒素hc片段表达载体为将a型肉毒毒素hc片段的编码基因序列连入pet-32a(+)载体后得到的载体；所述a型肉毒毒素hc片段的编码基因序列如序列表中序列9所示；a2)在所述重组菌的培养体系中添加1mm的iptg进行诱导培养，得到诱导后菌体；a3)从所述诱导后菌体中纯化得到所述a型肉毒毒素hc片段。

42、在本发明的一个实施方案中，所述兔子可为新西兰兔。

43、在本发明的一个实施方案中，所述免疫的方案可按照本技术领域的常规方案进行。

44、在本发明的一个实施方案中，所述1-1)还包括使用红细胞裂解液裂解外周血单个核细胞中残留红细胞的步骤。

45、在本发明的一个实施方案中，所述荧光素偶联抗体可以通过商业途径直接购买获得，也可以采用荧光标记试剂盒对抗体进行标记获得。其中，荧光素和抗体的选择遵循常规的流式实验所需遵循的原则即可。

46、在本发明的一个具体实施方案中，所述荧光素偶联抗体包括fitc标记的mouseanti rabbit cd4抗体(mouse anti rabbit cd4:fitc)、fitc标记的mouse anti rabbitcd8抗体(mouse anti rabbit cd8:fitc)、fitc标记的mouse anti rabbit t lymphocytes抗体(mouse anti rabbit t lymphocytes:fitc)、使用pe/cy7偶联试剂盒标记的mouseanti rabbit igm抗体、bv421标记的goat anti-rabbit igg抗体(bv421 goat anti-rabbit igg)、使用apc偶联试剂盒和pe/r-phycoerythrin偶联试剂盒进行双荧光标记的抗原(如上述a型肉毒毒素hc片段)。所述流式分选表达抗原特异性抗体(如a型肉毒毒素抗体)的单个b细胞的荧光标记组合为7-aad(percp-cy5)-/cd4:fitc-/cd8:fitc-/pan-t:fitc-/igm:pe-cy7-/igg:bv421+/抗原:apc+/抗原:pe+。

47、在本发明的一个实施方案中，所述cdna为向所述表达抗原特异性抗体的单个b细胞中加入反转录试剂进行反转录反应后得到的。

48、在本发明的一个具体实施方案中，所述反转录试剂包括4×allinone rt mixtureiv；所述反转录反应的条件为50℃15min，90℃1min。

49、在本发明的一个实施方案中，所述重链第一轮pcr扩增和所述轻链第一轮pcr扩增的反应体系及反应程序分别如下文实施例中的表3和表4所示。

50、上述2)所述的方法中，所述重链第二轮pcr扩增和所述轻链第二轮pcr扩增的反应体系及反应程序分别如下文实施例中的表5和表6所示。

51、上述3)所述的方法中，所述兔抗体可变区序列包括兔抗体重链可变区序列和兔抗体轻链可变区序列。在本发明的一个具体实施方案中，所述兔抗体重链可变区序列和所述兔抗体轻链可变区序列如下文实施例中“46个细胞的重链第二轮pcr产物的测序结果”部分和“46个细胞的轻链第二轮pcr产物的测序结果”部分所示。

52、上述方法在获得兔抗体可变区序列或制备兔抗体中的应用也属于本发明的保护范围。

53、上述任一所述成套引物对或试剂盒或应用或方法中，所述兔抗体为兔单克隆抗体。具体的，所述兔单克隆抗体的重链为igg类型；所述兔单克隆抗体的轻链为k1类型。

54、本发明提供了一种基于单个b细胞扩增兔单抗可变区序列的巢氏pcr引物对，可以在分选得到抗原特异性单个b细胞之后，直接进行巢氏pcr扩增，1-2天内得到配对的抗体轻重链可变区序列。本发明为兔抗体的快速开发提供了基础。