一种鉴定甜瓜果皮颜色的SNP分子标记及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种鉴定甜瓜果皮颜色的snp分子标记及其应用。

背景技术：

1、甜瓜(cucumis melo l.)是世界范围内广泛种植的一种重要经济作物。甜瓜的遗传资源丰富，可大致分为薄皮甜瓜和厚皮甜瓜两种类型，其果皮颜色、果实的大小和形状等性状多种多样。目前，市场上销售的薄皮甜瓜果皮颜色主要有绿色、白色、黄色以及多种颜色混杂的花斑类型。果皮颜色是一种重要的外观品质性状，直接影响消费者对甜瓜种类的选择，因此，培育具有各种果皮颜色的甜瓜品种以迎合市场需求一致是育种工作中的一项重要内容。但是，许多甜瓜品种的果皮颜色需要到成熟后才能完全显现出来，开展果皮颜色育种的选择周期较长且成本高。因此，鉴定、克隆甜瓜果皮颜色控制基因并开发特异功能性分子标记进行果皮颜色的早期分子标记辅助选择，将大大提高育种选择效率并降低生产成本。

2、甜瓜的果皮颜色主要受遗传调控，且受光照、温度等环境的影响。关于甜瓜果皮颜色遗传规律及相关qtls或基因定位的研究早有报道。杨光华等研究表明听甜瓜黄绿色果皮对白色果皮为显性，并通过构建遗传连锁图谱将控制果皮底色的基因定位到4号染色体约425kb的区间内。kasp(kompetitive allele specific pcr，竞争性等位基因特异pcr)是一种基于单核苷酸多态性(snp)的新型基因分型技术，可从基因组水平对snp和插入缺失多态性(indel)位点进行精准分型，被广泛应用于农业科学研究领域。利用该类标记以及英国lgc(laboratory of the government chemist)有限公司开发的snpline基因分型系统来进行目标群体的snp检测服务，具有准确、灵活、低成本和高通量的特点，大可以大大提高检测效率，缩短甜瓜传统育种周期，加快育种进程，满足甜瓜果皮颜色育种的实际需要。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是如何提高木兰纲植物的抗旱性，尤其是拟南芥和小麦。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了下述应用。

3、检测snp的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定甜瓜果皮颜色，或，制备鉴定或辅助鉴定甜瓜果皮颜色产品，或，甜瓜育种或制备甜瓜育种产品中的应用，所述snp是甜瓜基因组的一个单核苷酸多态性位点，为序列表中seq idno.4的第99位核苷酸，其为g或a。

4、所述物质可为产品。所述检测物质可包括检测上述单核苷酸多态性的试剂、试剂盒和仪器。具体的说，为检测上述单核苷酸多态性进行核酸体外扩增所需的引物和/或其他试剂和仪器。

5、本技术中，所述snp的基因型可为基因型gg、基因型aa或基因型ga，基因型gg是snp为g的纯合型；基因型aa是snp为a的纯合型合型；基因型ga是snp为g和snp为a的杂合性。

6、为了解决上述技术问题，本发明还提供了产品。

7、所述产品含有上述检测甜瓜基因组snp的多态性或基因型的物质的产品，且可为下述g1)-g3)中的任一种：

8、g1)检测甜瓜果皮颜色相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

9、g2)鉴定或辅助鉴定甜瓜果皮颜色的产品；

10、g3)用于甜瓜育种的产品。

11、为了解决上述技术问题，本发明提供了鉴定或辅助鉴定甜瓜果皮颜色的方法。

12、所述方法为鉴定或辅助鉴定甜瓜果皮颜色的方法，包括检测待测甜瓜中上述snp的基因型，根据待测甜瓜的所述基因型鉴定或辅助鉴定甜瓜果皮颜色：

13、所述snp的基因型为基因型gg和ga的甜瓜果皮颜色为绿色，所述snp的基因型为基因型aa的甜瓜果皮颜色为白色。

14、基因型gg是序列4的第99位为g的纯合型。基因型aa是序列4的第99位为a的纯合型。基因型ga是序列4的第99位为g和序列4的第99位为a的杂合型。

15、作为一种实施方案，所述鉴定或辅助鉴定甜瓜果皮颜色方法可包括如下步骤：

16、(1)以待测甜瓜的基因组dna为模板，采用引物组f1进行kasp；

17、引物组f1可包括引物f1-a、引物f1-b和引物f1-c；；

18、所述引物f1-a可为核苷酸序列是序列1的单链dna分子；

19、所述引物f1-b可为核苷酸序列是序列2的单链dna分子；

20、所述引物f1-c可为核苷酸序列是序列3的单链dna分子。

21、(2)完成步骤(1)后，进行荧光检测，确定待测甜瓜的所述snp位点的基因型；

22、(3)根据基因型结果进行鉴定或辅助鉴定甜瓜果皮颜色：所述snp位点的基因型为基因型gg和基因型ga的待测甜瓜的果皮颜色为绿色，基因型aa的待测甜瓜的果皮颜色为白色。

23、上述的应用、上述的产品或上述的方法中，所述甜瓜为甜瓜纯系或自交系。

24、上述方法在甜瓜育种中的应用。

25、所述育种的目标包括果皮颜色。所述育种的目标可为绿色果皮(甜瓜果皮颜色为绿色)或白色果皮(甜瓜果皮颜色为白色)。

26、上述的应用、上述的产品、上述的方法或上述的应用、产品或方法中，所述育种的目的包括培育或选育低白色或绿色果皮颜色的甜瓜。

27、上述的应用、上述的产品、上述的方法或上述的应用、产品或方法中，所述检测snp的多态性或基因型的物质，为如下d1)、d2)、d3)或d4)：

28、d1)含有特异性扩增snp位点的体外核酸扩增引物；

29、d2)含有d1)所述体外核酸扩增引物的体外核酸扩增试剂；

30、d3)含有d1)所述体外核酸扩增引物或d2)所述体外核酸扩增试剂的试剂盒；

31、d4)含有d1)所述体外核酸扩增引物、d2)所述体外核酸扩增试剂或d3)所述试剂盒的检测仪器。

32、所述体外核酸扩增技术可为聚合酶链式反应(pcr)、链替代扩增(sda)、连接酶链式反应(lcr)和依赖核酸序列的扩增(nasba)、滚环核酸扩增(rca)、环介导等温扩增(lamp)、依赖解旋酶的等温扩增技术(hda)或qβ复制技术。

33、本技术以聚合酶链式反应(pcr)为扩增手段，进行多态性检测。

34、d1)中所述特异性扩增可通过扩增产物的有无或者通过扩增产物的有无再结合探针等辅助试剂来检测snp多态性位点的核苷酸序列。

35、上述应用、方法和产品中，所述体外核酸扩增引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(dig)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测。

36、上述的应用、产品或方法中，所述体外核酸扩增引物包括引物组f1，引物组f1包括引物f1-a、引物f1-b和引物f1-c；；

37、所述引物f1-a可为核苷酸序列是序列1的单链dna分子；

38、所述引物f1-b可为核苷酸序列是序列2的单链dna分子；

39、所述引物f1-c可为核苷酸序列是序列3的单链dna分子。

40、上述应用和方法中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由pcr引物、parms master mix试剂、酶标仪和在线软件snp decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由pcr引物、parms master mix试剂、在线软件snp decoder和荧光定量pcr仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测甜瓜基因组中snp1和snp2位点的多态性或基因型的物质。

41、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种白色果皮甜瓜育种的方法。

42、所述方法包括将目的甜瓜两条染色体中序列4区域的第99位核苷酸均替换为a，得到白色果皮的甜瓜。

43、所述甜瓜为纯合植株

44、所述甜瓜的基因型可为序列4区域的第99位核苷酸为a的纯合型。

45、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种白色果皮甜瓜育种的方法。

46、所述方法包括将目的甜瓜一条染色体中序列4区域的第99位核苷酸替换为g，得到绿色果皮的甜瓜。

47、所述甜瓜为纯合或杂合植株。

48、所述甜瓜育种的方法可为将所有染色体上的序列4区域的99位核苷酸进行替换得到纯合甜瓜。或先将一条染色体上的序列4区域的进行替换再通过有性繁殖进行纯合筛选获得纯合甜瓜。

49、所述甜瓜的基因型可为序列4区域的第99位核苷酸为g的纯合型。

50、所述甜瓜的基因型可为序列4区域的第99位核苷酸为g和序列4区域的第99位核苷酸为a的杂合型。

51、甜瓜基因组中序列4区域第99位核苷酸为g或第99位核苷酸为a对应不同果皮颜色在下任一中的应用：

52、(1)调控甜瓜果皮颜色；

53、(2)制备调控甜瓜果皮颜色的产品；

54、(3)甜瓜育种；

55、(4)制备甜瓜瓜果皮颜色育种产品；

56、(5)检测甜瓜瓜果皮颜色相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

57、(6)鉴定或辅助鉴定甜瓜瓜果皮颜色的产品。

58、上文所述应用及方法中，可选择甜瓜自交系作为亲本进行育种。

59、所述育种的目的包括培育或选育果皮颜色白或绿颜色的甜瓜。

60、上述应用和方法中，所述pcr引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如32p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(dig)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。

61、上述应用和方法中，所述产品可为试剂或试剂盒或系统，所述系统可包括试剂或试剂盒、仪器和分析软件的组合产品，如由pcr引物、parms master mix试剂、酶标仪和在线软件snp decoder(http://www.snpway.com/snpdecoder01/)组成的产品，由pcr引物、parms master mix试剂、在线软件snp decoder和荧光定量pcr仪组成的组合产品。所述产品可包括上述检测甜瓜基因组中snp1和/或snp2位点的多态性或基因型的物质。

62、有益效果

63、本发明公开了一种鉴定甜瓜果皮颜色的snp分子标记及其应用。解决的技术问题是提供鉴定甜瓜果皮颜色的snp分子标记。具体公开了检测snp的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定甜瓜果皮颜色，或，制备鉴定或辅助鉴定甜瓜果皮颜色产品，或，甜瓜育种或制备甜瓜育种产品中的应用，所述snp是甜瓜基因组的一个单核苷酸多态性位点，为序列表中seq id no.4的第99位核苷酸，其为g或a。通过检测检测甜瓜中seq id no.4的第99位核苷酸，可以鉴定或辅助鉴定待测甜瓜果皮颜色。可用于农业生产。