一种高产表面活性素工程菌及其构建方法和应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种高产表面活性素工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、生物表面活性素(surfactin)是一种环状脂肽，由枯草芽孢杆菌经非核糖体肽合成途径(nrps)合成的长链脂肪酸(c12-c17)和含7个氨基酸的多肽经内酯键连接而成，具有显著的表面活性，乳化活性，和抗菌，抗病毒，抗癌，溶血栓等生物活性，在食品日用，生物制药，原油回收，环境修复等领域具有广泛的工业应用价值。生物表面活性素的广谱抗菌功效有望弥补现今普遍存在的抗生素耐药性难题，其抗病毒和抗肿瘤功能也为新型药物设计提供了一些可选方案，surfactin优越的表面活性功能(能够将水分子的表面张力从72mn/m降低至27mn/m)使其在化妆品，医药，乳化剂，保湿剂和精细化工中有着广泛的应用前景，而绝大多数芽孢杆菌菌株产量仅有50-600mg/l，严重限制了surfactin的生产实践应用。

2、目前，通过基因工程的方法提高野生型芽孢杆菌表面活性素的产量是目前研究的一个热点。专利cn 102220367公开了在枯草芽孢杆菌atcc 9943中敲除abrb基因构建了枯草芽孢杆菌fmb29，surfactin产量从777mg/l提高至1091mg/l，较野生型提高了40.4％；cn110331121、cn 109097315和cn 109554321分别公开了在thy-7/pg3-srfa中过表达leuabcd-ilvk、过表达yngh基因、敲除spoivb基因，surfactin产量分别提高了55.6％、47％、25％；cn 106635869公开了利用基因工程技术来增加枯草芽胞杆菌168中surfactin的产量，该研究中通过对已经报道的surfactin脂肪链代谢途径、surfactin合成基因簇及调控因子和surfactin外泌及耐受基因进行了突变或者增强表达，最终将surfactin的产量显著提高。在现有研究中，研究者以枯草芽孢杆菌atcc 21332菌株为出发菌株，仅通过优化培养基中微量元素和添加固体载体活性炭就将其surfactin产量分别提高了3.5倍、36倍，可见该菌株具有较大的开发潜力，但是对于枯草芽孢杆菌atcc 21332菌株，并没有系统的基因工程改造方法来提升其表面活性素产量。

3、因此，本发明中，将利用crispr-cas9技术对枯草芽孢杆菌atcc 21332菌株进行理性改造，主要通过增强srfa合成酶表达来提高surfactin产量。

技术实现思路

1、为了实现上述目的，本发明所述一种高产表面活性素的基因工程菌，所述基因工程菌以枯草芽孢杆菌为出发菌株，敲除菌株基因组中srfa合成酶负调控因子cody、phop基因所得。作为优选，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌atcc 21332。

2、本发明所述高产表面活性素的基因工程菌的构建方法包括以下步骤：

3、(1)参考sgrna的设计网站http://chopchop.cbu.uib.no/获得敲除靶点sg-cody、phop的sgrna，经pcr得到含有20bp的sgrna基因片段，通过同源重组连入载体pjoeoe8999得到质粒pjoe-sg-cody/phop；

4、(2)根据敲除靶点cody、phop上下游同源臂核苷酸序列seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4设计pcr引物，以b.subtilisatcc 21332基因组为模板，扩增上下游同源臂基因片段cody-up/down、phop-up/down片段；

5、(3)将步骤2)中上下游同源臂基因片段cody-up/down、phop-up/down基因片段通过重叠pcr构建重叠片段rh-cody、rh-phop；

6、(4)将步骤3)中构建重叠片段rh-cody、rh-phop通过同源重组连入pjoe-sg-cody/phop载体，构建重组质粒(命名为pjoe-cody/phop)，通过spizizen方法转化入b.subtilisatcc 21332构建工程菌株；

7、(5)将步骤3)成功构建的质粒pjoe-phop，通过spizizen方法转化入步骤3)、4)中构建好的b.subtilisatcc 21332-δcody菌株为宿主工程菌株，构成b.subtilis atcc21332-δcody-δphop；

8、(6)利用步骤4)、5)中构建好的基因工程菌株发酵生产表面活性素。

9、所述表面活性素基因工程菌进行摇瓶发酵：将菌种活化后制备种子液，按照体积比10-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，于37℃，220rpm发酵40-50h。

10、所述发酵培养基组成为：葡萄糖10-30g/l，谷氨酸5-10g/l，kh2po41-5g/l，mgso40.2-0.5g/l，kcl 0.2-1g/l，mnso4·h2o 5-10mg/l，cuso4·5h2o 0.1-0.5mg/l，feso4·7h2o 0.1-0.5mg/l，其余为水，ph 6.0-8.0。

11、步骤(2)所述引物核苷酸序列如下(划线部分为同源臂)：

12、pjoe-cody-uf:tatagggtcgacggccatcacaaaatatggttctgtaaaacagacc

13、pjoe-cody-ur:agaaccctcaaaaagggttctttttgtgagataaataatcctcctaaacattcctcatattaaa

14、pjoe-cody-df:ttgtgaaaaatttaatatgaggaatgtttaggaggattatttatctcacaaaaagaaccctttttgaggg

15、pjoe-cody-dr:agatgaagattatttcttaatttgccttatagttcggtgtatctatattgg

16、pjoe-phop-uf:tatagggtcgacggccaaaaaataaacaatgacgataaatgcggtac

17、pjoe-phop-ur:cggggaattataatactggaggcacagcataccgtgtgcgcctt

18、pjoe-phop-df:tacagaaaaaaggcgcacacggtatgctgtgcctccagtattataattc

19、pjoe-phop-dr:agatgaagattatttcttaatggcgaaatcgtgaatcttcttg

20、本发明的有益效果：

21、本发明以b.subtilis atcc 21332为出发菌株，在基因组上敲除表面活性素合成酶负调控因子cody、phop来加强srfa合成酶表达，可以显著提升surfactin的产量，在摇瓶发酵48h最高可达4.25g/l，较出发菌株b.subtilisatcc 21332提高了51.8％，具有重要的工业应用价值，该表面活性素高产基因工程菌及其构建方法为加速其工业化生产提供原材料。