木霉和绿僵菌共生发酵抑制禾谷镰孢菌的方法

本发明涉及生防菌，涉及一种木霉和绿僵菌共生发酵抑制禾谷镰孢菌的方法，具体涉及一种提高木霉和绿僵菌共生发酵液产生活性物质抑制禾谷镰孢菌的方法。

背景技术：

1、玉米(zea mays l.)在全世界范围内广泛地种植。玉米根腐病是可以由多种镰孢菌单独侵染或者多种镰孢菌组合一起侵染引起的，在镰孢菌中有禾谷镰孢菌、拟轮枝镰孢菌作为主要致病菌。禾谷镰孢菌在侵染玉米后会产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)、雪腐镰刀菌烯醇(niv)和玉米赤霉烯酮(zen)等多种真菌毒素，严重危害着人和牲畜的身体健康和生命安全。研究表明，don毒素可导致猪的采食量减少、呕吐、肌肉出血和繁殖性能下降，niv的摄入会影响生长、免疫系统和女性生殖系统，zen及其代谢产物会干扰雌激素功能，影响动物的生殖能力。因此，防治由禾谷镰孢菌引起的病害是十分有必要的。

2、诸多研究表明，在有害生物综合治理(ipm)中，利用微生物进行生物防治，作为可持续的创新型产品受到越来越多的关注。尽管单一生防菌剂已取得不错的效果，可是施用单一生防菌仍具备防治效果不稳定、防治谱窄，抗逆性低等缺点，将多种微生物复配使用增强了生物防治性能和防治效果的稳定性，加大了防治的广谱性，多靶标防治降低了病虫害的产生抗性的可能性，具有很好的应用前景，因而，联合抗菌及其机理的研究是植物病害防治的趋势。

3、木霉和绿僵菌是重要的生防菌，两菌因其制剂对生态环境无害且在植保方面效果好而分别在防病和防虫方面得到广泛的应用。但目前仅限于单一使用或将二者简单复配。尽管单一生防菌剂已取得不错的效果，可是施用单一生防菌仍具备防治效果不稳定、防治谱窄，抗逆性低等缺点，将多种微生物复配使用增强了生物防治性能和防治效果的稳定性，加大了防治的广谱性，多靶标防治降低了病虫害的产生抗性的可能性，具有很好的应用前景，因而，联合抗菌防治植物病害是防治的趋势。

4、在微生物共培养过程中，菌和菌之间的相互作用贯穿整个过程，利用共培养的方法来组成的复合菌剂可以使拮抗性物质、促生性物质等的种类与产量提高。有研究证明一些微生物共培养后比单一培养的生防功能要好：q ma等研究发现将解淀粉芽孢和长枝木霉混合培养发酵，混合培养发酵液对番茄枯萎病的生防效果显着高于长枝木霉和解淀粉芽孢单独培养发酵；陈凯等利用木霉hb20111和木霉tw21990共培养发酵对麦子苗期茎基腐病的防效明显高过单一菌种。shobha等将哈茨木霉和2株里氏木霉、三株菌株共同培养，研究发现其产物可以通过先与水稻白叶枯病菌的靶蛋白结合，达到阻断其蛋白的活性。tingtingli等将芽胞杆菌b22和木霉3403共培养，发酵液中抗真菌和增强植物生长的代谢物增加，代谢产物能够更显着地减少禾谷镰孢菌赤霉素(ga)，脱氧雪腐镰孢菌烯醇(don)和玉米赤霉烯酮(zen)的产生；共培养的木霉-芽胞杆菌通过触发寄主植物防御基因(包括pr1、pr3、pr4、pr5、acs和sod)的表达，对禾谷镰孢菌感染有显著效果。木霉和芽孢杆菌共培养后所得到的发酵液还能够防治烟草黑胫病，相对于单培养，防治效果显著提升，能够抑制禾谷镰孢菌生长并增加病原g蛋白和丝裂原活化蛋白激酶(mapk)的活性。

5、绿僵菌的杀虫功能主要是其分生孢子产生作用，但其在防治植物病害时，研究人员将关注点放在绿僵菌的发酵液，并发现绿僵菌发酵滤液产生的挥发性气体可能对植物病原菌有抑制作用。

6、木霉和绿僵菌是应用广泛的生物防治微生物，各有优势。木霉已有用于玉米根腐病的防治研究，绿僵菌虽主要防治地下害虫，但是也有文献报道其对病害也有防治作用。通过两种微生物的共同培养，在协同提高生物防治和植物促进的效果方面，几乎没有相关研究，对共培养代谢产物与其对镰孢菌影响的关系尚无深入研究。同样目前还存在一些尚未解决的问题，如：(1)木霉和绿僵菌生长速度不同，协同培养难；(2)木霉对绿僵菌生长有不同程度的抑制作用；(3)木霉和绿僵菌共培养后代谢物变化以及抑菌原因不清。将二者共培养为创制二者共培养的新型微生物杀菌剂奠定了基础，为攻克玉米根腐病的可持续发展型防治的难题提供绿色防控新思路。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术存在的不足，提供了一种木霉和绿僵菌共生发酵抑制禾谷镰孢菌的方法。采用本发明筛选出来的木霉和绿僵菌及其共培养条件，共培养发酵液对两菌孢子的正常生长发育没有影响，且可以提高共培养发酵液中几丁质酶、壳聚糖酶、β-葡聚糖酶等的活性，分别显著高于单独培养木霉或绿僵菌的活性，共培养发酵液对禾谷镰孢菌的抑制率也显著高于分别单独培养的作用。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种木霉和绿僵菌共生发酵抑制禾谷镰孢菌的方法，所述木霉为深绿木霉(trichoderma atroviride)cjccsj-f-ky10039，保藏编号为cctcc no.m20221135，所述绿僵菌为金龟子绿僵菌(metarhizium anisopliae)b81755。

4、第二方面，本发明提供了一种微生物杀菌剂，所述微生物杀菌剂含木霉和绿僵菌的共生发酵产物；所述木霉为深绿木霉(trichoderma atroviride)cjccsj-f-ky10039，其保藏编号为cctcc no.m 20221135；所述绿僵菌为金龟子绿僵菌(metarhiziumanisopliae)b81755。

5、所述微生物杀菌剂中活性成分含深绿木霉和金龟子绿僵菌的共生发酵产物。

6、优选地，所述共生发酵包括以下步骤：

7、s1、将木霉和绿僵菌的孢子分别制成孢子悬浮液；

8、s2、分别取木霉和绿僵菌的孢子悬浮液接种到培养基中培养。

9、优选地，步骤s2中所述木霉和绿僵菌的接种次序为同时接种。

10、优选地，所述孢子悬浮液的浓度为106-2×106个孢子/ml。

11、优选地，步骤s2中所述接种的接种比例为1:1。

12、优选地，所述孢子悬浮液的制备方法包括：用移液枪枪头分别在长有木霉和绿僵菌的平板上摩擦，使枪头上沾满孢子，将沾满孢子的枪头放进无菌水中，制得孢子悬浮液。

13、优选地，所述培养的条件包括：培养温度为25-30℃，转速为180-250r/min。

14、优选地，所述培养基包括pd培养基。

15、优选地，所述接种的接种量为1/100。

16、优选地，所述培养时间为5-10d。

17、优选地，与单一培养相比，共培养发酵液中抑菌活性物质水平上调，抑菌活性物质包括异硫氰酸盐、蛇床子素、螺环菌胺等物质。

18、优选地，与单一培养相比，共培养发酵滤液处理后禾谷镰孢菌中几丁质合成酶相关基因的表达量下调，细胞p450单加氧酶相关基因的表达量上调。

19、优选地，与单一培养相比，共培养发酵滤液的β-葡聚糖酶和壳聚糖酶活性增加。

20、在一些实施例中，共培养发酵液中几丁质酶活性为242.72iu/l。共培养发酵液中壳聚糖酶活性为269.86u/l。共培养发酵液中β-葡聚糖酶活性为497.53u/l。共培养发酵液对禾谷镰孢菌的抑制率为63.3％。

21、所述深绿木霉cjccsj-f-ky10039保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为cctcc no.m 20221135，保藏日期为2022年7月19日。

22、第三方面，本发明提供了一种上述微生物杀菌剂在抑制禾谷镰孢菌中的应用

23、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

24、(1)本发明筛选获得的是对禾谷镰孢菌有一定拮抗作用的木霉和绿僵菌菌株，从绿僵菌和木霉各自的生长速度、平板对峙和液体共培养的亲和性以及对禾谷镰孢菌的抑菌率出发，选取绿僵菌中生长最快、木霉中生长较慢、二者平板显示亲和且共培养发酵液滤液对禾谷镰孢菌有抑菌作用的组合，发现深绿木霉(trichoderma atroviride)cjccsj-f-ky10039和金龟子绿僵菌(metarhizium anisopliae)b81755的共培养组合综合优于其他组合，共培养发酵液对禾谷镰孢菌的抑制率达到了63.3％；

25、(2)本发明通过对木霉和绿僵菌共培养，发现共培养发酵液中具有抑菌活性物质上调，比如异硫氰酸盐、蛇床子素、螺环菌胺等物质，这些物质是已有文献报道的具有抑菌功能的代谢产物，对禾谷镰孢菌起到抑菌作用；

26、(3)按照两个菌株的生长速率来筛选组合，避免了木霉在培养的过程中将空间和营养全部利用从而导致绿僵菌无法正常生长；

27、(4)为尽量避免二者在共培养时受到生长抑制，确定了木霉和绿僵菌同时接种的接种次序和两菌按1:1的接种比例接种，对创制新型共培养发酵滤液起着至关重要的作用；

28、(5)由对转录组测序分析筛选出1029个与其他处理组特异的共培养发酵滤液处理禾谷镰孢菌后所受到影响的基因，发现共培养发酵滤液处理后禾谷镰孢菌相对于单培养几丁质合成酶、细胞p450单加氧酶等相关基因的表达量发生了变化，说明共培养发酵滤液可能通过影响几丁质合成、菌丝生长发育、mapk信号途径等相关的生物功能来抑制禾谷镰孢菌；

29、(6)除几丁质外，真菌角质层的基本成分还包括壳聚糖和β-葡聚糖，壳聚糖在被壳聚糖酶降解后为小分子具有抗菌能力的壳寡糖，β-葡聚糖酶降解β-葡聚糖后作用产物低聚糖也可以诱导产生其他抗病相关酶系，进而提高植物的抗病性。酶活测定发现，共培养发酵滤液的β-葡聚糖酶和壳聚糖酶活性分别为：497.53u/l和269.86u/l，均高于木霉和绿僵菌的单独培养。因此，共培养后几丁质酶、β-葡聚糖酶和壳聚糖酶活性增加对抑菌有增效作用。

30、(7)除了抗菌物质以外，在以木霉单培养发酵滤液为对照组，共培养为处理组中还发现代谢途径中：玉米素的合成发生了显著的变化，有研究表明玉米素可作为植物生长调节剂，可帮助作物增产抗病。