一种基于环介导等温扩增技术的水体污染源检测方法与流程

本发明涉及水体污染源解析，具体是涉及一种基于环介导等温扩增技术的水体污染源检测方法。

背景技术：

1、随着我国畜禽养殖业的飞速发展，粪便污染已成为地表水和饮用水水质恶化的主要诱因之一，粪便中携带的致病微生物进入水体，会引起水源性疾病的爆发，对人类健康构成重大威胁。

2、微生物溯源分析是通过比较污染样品与污染源中的特异性微生物群落结构或其生物标记的有无来判断样品与污染源之间的关系，以便确定其可能的污染来源。目前，大多数国家采用粪大肠菌群或大肠埃希氏菌等传统指示微生物来反映水体微生物污染状况，但它们缺乏宿主特异性而无法追溯粪便污染来源，难以达到“精准治污、科学治污”的目的。微生物污染源解析(mst)技术的出现则解决了这一难题，该技术是基于不同宿主肠道微生物的差异，利用宿主特异性或与宿主相关的微生物指标建立鉴别粪便污染源。目前，mst主要有库依赖法和非库依赖法。

3、库依赖法是通过对不同来源动物粪便16s rrna基因进行高通量测序，然后构建粪便源解析文库(ftl)，并通过机器学习方法与水样中的微生物群落进行对比，最终识别出微生物污染来源及相对贡献量。该技术需要对不同来源动物粪便16s rrna基因进行高通量测序，测序数据庞大，测序和分析所需时间较长，测序数据分析需要一定的专业基础；

4、非库依赖法以实时荧光定量pcr(qpcr)技术为主，需要热循环等昂贵仪器，对操作人员要求有一定技术背景，对常规检测人员来说条件不友好，样品需运回实验室进行实验分析，无法在采样点现场快速的进行污染源解析。

5、与上述方法对应的，环介导等温扩增(lamp)技术无需热循环仪等昂贵仪器，在60～65℃等温过程即可快速扩增目的基因，且反应时间较短(1h内)，对操作人员要求低，实验所需设备便宜。

6、但目前lamp的研究领域主要集中在临床或疾病流行区中的致病菌微生物、寄生虫的快速检测，关于水体中识别宿主特异性微生物进而解析污染来源的研究较少。本研究针对人源、猪源、反刍源、禽源粪便标记物源指示微生物进行lamp体系构建与优化，将lamp技术应用于现场快速识别宿主特异性微生物解析污染来源，旨在为管理者提供相关的污染来源信息以制定及时有效的污染防治措施。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是：现有的微生物污染源解析技术难以实现现场快速识别宿主特异性微生物进而解析粪便污染来源。

2、为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

3、一种基于环介导等温扩增技术的水体污染源检测方法，其特征在于，

4、s1、采集水样，提取水样dna；

5、s2、确定需要检测的污染源，污染源为人源、反刍源、猪源、禽源中的一种；

6、s3、向环介导等温扩增检测的反应体系加入水样dna，反应体系中含有与需要检测的污染源对应的源指示微生物的特异性基因片段的引物，对水样dna中的源指示微生物的特异性基因进行扩增；

7、s4、观察lamp扩增反应是否出现荧光强度的增加，如果出现荧光强度增加，则表明水体dna中存在源指示微生物的特异性基因，进而得出水体中存在对应的污染源。

8、在步骤s3中，每个反应体系中仅包含一种源指示微生物，只能对一种污染源进行检测，针对不同的污染源采用含有对应污染源的源指示微生物的反应体系执行步骤s1-s4；每个源指示微生物具有特异性基因。

9、优选地，还包括如下步骤：

10、步骤s5、计算lamp扩增反应中荧光曲线上各点的二阶导数，将二阶导数最大值的点对应的循环数作为步骤s3中扩增反应的cq值；

11、步骤s6、将cq值代入到对应的定量标准曲线，得出水样dna中的目的基因拷贝数的对数，进而得出目的基因拷贝数；

12、步骤s7、根据目的基因拷贝数和水样的体积将得到的目的基因拷贝数换算成log10 gc/100ml，得到水样中相应污染源的量。

13、优选地，所述宿主标记物包括：人源标记物hf183、反刍动物标记物rum-2-bac、猪源标记物pig-2-bac和禽类标记物gfd，对应于不同宿主标记物的定量标准曲线如下：

14、对应人源标记物hf183的定量标准曲线：y＝-3.361*x+34.87，

15、对应反刍动物标记物rum-2-bac的定量标准曲线：y＝-2.001*x+25.93，

16、对应猪源标记物pig-2-bac的定量标准曲线：y＝-1.600*x+18.01，

17、对应禽类标记物gfd的定量标准曲线：y＝-1.819*x+21.14，

18、其中，y为cq值，x为log10 copies，copies为基因拷贝数。

19、优选地，环介导等温扩增引物组的序列为seq id no：1～seq id no：24。

20、优选地，各宿主标记物对应的环介导等温扩增引物组序列均由一对外引物f3/b3、一对内引物fip/bip和一对环引物loop f/loop b组成。

21、优选地，所述各宿主标记物的源指示微生物包括：与人源对应的特异性拟杆菌属、与反刍源对应的特异性拟杆菌属、与猪源对应的特异性拟杆菌属、与禽源对应的螺杆菌属。

22、优选地，用于检测人源和禽源为污染源的反应体系为：warmstart lamp 2xmaster mix占总体积的50％、10x primer mix占总体积的10％、50xfluorescent dye占总体积的2％、dna模板占总体积的8％，其余为rnase-free ddh2o；

23、和/或，

24、用于检测反刍源和猪源的反应体系为：warmstart lamp 2x master mix占总体积的50％、10x primer mix占总体积的7.5％、50x fluorescent dye占总体积的2％、dna模板占总体积的8％，其余为rnase-free ddh2o。

25、本发明还提供了一种基于环介导等温扩增技术的水体污染源检测方法，

26、步骤s5、对步骤s3中发明lamp扩增反应的源指示微生物的特异性基因进行识别，确定污染类的类型；

27、步骤s6、计算lamp扩增反应中荧光曲线上各点的二阶导数，将二阶导数最大值的点对应的循环数作为步骤s3中扩增反应的cq值；

28、步骤s7、将cq值代入到对应的定量标准曲线，得出水样dna中的目的基因拷贝数的对数，进而得出目的基因拷贝数；

29、步骤s8、根据目的基因拷贝数和水样的体积将得到的目的基因拷贝数换算成log10 gc/100ml，得到水样中相应污染源的量。

30、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

31、(1)本发明采用环介导等温扩增(lamp)技术有效地解决了现有的mst技术难以实现现场快速识别宿主特异性微生物进而解析粪便污染来源这一难题。lamp技术针对靶基因的6个区域设计4种特异引物和环状引物，在无需热循环仪等昂贵仪器的情况下，利用链置换dna聚合酶(bst dna polymerase)在60～65℃恒温扩增，15～60min内即可快速扩增目的基因，相比于高通量测序和qpcr，该技术具有价格成本低、特异性高、灵敏性高、反应时间短和易于操作等优点，是一种潜在的可在现场快速解析水体微生物污染来源的技术，能够快速地为管理者提供相关的污染来源信息以制定及时有效的污染防治措施；

32、(2)本发明针对人源标记物hf183、反刍动物标记物rum-2-bac、猪源标记物pig-2-bac和禽类标记物gfd的指示微生物基因序列所设计的lamp引物的核苷酸序列，能够快速对环境水体进行污染源解析。