用于合成头孢克洛的青霉素酰胺酶的制作方法

本发明属于生物催化，具体地说，涉及一种青霉素酰胺酶及其用于合成头孢克洛的方法。

背景技术：

1、青霉素酰胺酶，又称青霉素g酰化酶(penicillin g amidase，e.c.3.5.1.11，简称pga)是制备半合成β-内酰胺类抗生素中的重要用酶，该酶主要用于水解合成6-氨基青霉烷酸(6-apa)、7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-adca)等；同时pga还可用于催化母核6-apa、7-adca、7-acca等与各种d-氨基酸侧链反应生成新的半合成β-内酰胺抗生素。另外，青霉素酰胺酶在一些手性化合物合成过程中可以用于保护羟基和氨基、拆分手性化合物等。但目前针对pga水解性能应用报道相对较多，研究焦点大部分集中在其酶活性的提升。在制药工业中，酶催化反应的实际工艺涉及到多个方面，包括比活力、选择性、底物/产物抑制性、ph、温度、稳定性等。

2、头孢克洛(cefaclor)化学名为(6r,7r)-7-[(r)-2-氨基-2-苯基乙酰胺基]-3-氯-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸一水合物，1975年由美国礼来公司研发，1982年作为第二代头孢菌素在美国上市，其抗菌谱较宽，对肺炎球菌、化脓性链球菌、葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌和肺炎杆菌、流感嗜血杆菌、淋病双球菌、厌氧菌等均具有良好的抗菌活性，是临床上常用的口服类头孢菌素，多年来一直是全球畅销口服头孢类抗生素。

3、头孢克洛目前有化学合成和酶法合成两种工艺，其中化学合成多采用酰氯法和混合酸酐法，反应步骤多，条件苛刻，且污染严重。酶法工艺则是利用青霉素酰化酶催化7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-酸(7-acca)和d-苯甘氨酸甲酯盐酸盐(d-pgm.hcl)合成头孢克洛。

4、

5、酶法工艺的反应步骤少，操作简单，无毒害，成本低、收率高，是一种具有良好应用前景的绿色合成技术，工业上已经逐步取代化学合成工艺。但目前工业上的pga对底物7-acca的合成活力相对较低，反应时间长，底物侧链比相对比较高，开发针对7-acca底物高合成活力的青霉素酰化酶成为该工业开发的重要方向。

6、发明人曾在专利cn105483105b中报道了无色杆菌achromobacter sp.ccm 4824来源的青霉素g酰化酶突变体具有催化7-acca和d-pgm.hcl合成头孢克洛的较好性能，合成活力较高。

技术实现思路

1、目前工业化实施的酶法合成头孢克洛工艺普遍存在如下缺陷：低ph时酶活力较低，反应时间长，底物苯甘氨酸酯盐不稳定自身水解严重；而高ph反应时头孢克洛和底物苯甘氨酸酯盐易水解。因此反应整体显示出底物转化率低，母核7-acca反应残留高、侧链苯甘氨酸酯盐的加量大等问题，因此需要开发对母核7-acca的底物亲和力(底物高浓度耐受性)更高、且在低ph(比如ph6.8或更低)条件下合成活力高的酶，用于改善酶法合成头孢克洛的工艺。我们对于更多微生物来源的青霉素酰胺酶种类进行了广泛筛选，比较它们的立体专一性、合成比活力、ph适用范围、s/h值(合成产物/水解产物比值、合成/水解比值)、热稳定性等工业生产工艺指标。通过对数十种微生物来源的野生型青霉素酰胺酶进行对比，发现一种来源于伊平屋海岭海洋芽孢杆菌(伊赫氏海洋芽孢杆菌，oceanobacillus iheyensis)的青霉素酰胺酶(uniprot序列号q8cx57)对催化底物7-acca与d-pgm.hcl反应生成头孢克洛时具有较好的促合成性能，合成/水解比值即s/h值(产物头孢克洛与副产品d型-苯甘氨酸(d-pg)的摩尔比)相对较高，立体专一性高，但是在低ph时的酶活力偏低，导致d-pgm和7-acca底物反应添加摩尔比一直较高。于是接着对该酶进行随机突变，还得到了一些酶活力进一步提高的突变体。基于该研究，本发明包括如下技术方案。

2、一种酶催化制备头孢克洛的方法，包括如下步骤：以7-氨基-3-氯-3-头孢烯-4-酸(7-acca)和d-苯甘氨酸甲酯盐酸盐(d-pgm.hcl)为底物，使用oceanobacillus iheyensis来源的青霉素酰胺酶(uniprot序列号q8cx57)或者其酶活力提高的突变体催化合成反应，得到头孢克洛。

3、其中，oceanobacillus iheyensis来源的野生型青霉素酰胺酶(uniprot序列号q8cx57)的氨基酸序列如seq id no:1所示：

4、mgerqreqvsqpkkkrrirtkkillgglgsifllaliaflfvngyinkslpqtegtmelpmldnevtvitdedgvphiqaetardmyiaqgyiqadrrmfqmelsrrqasgtlsevvgedalnqdkyfrtlglrraaeksyevyseesvevlewfstgvnaymeeakannslpveftlmdfepeewtpvdsltigkfmafdlgghwqqqafnyylldnyeqekayelfpsypenkptiiqdeeidiaasfehaviphpfngsnnwvvsgdktasgmplladdphlglatpsiwlqmhlesgdglnvsgvifagvpgiilghneqiawgvtntgpdvqqlyieqrnpdnpheflfedeweeatvmeepikvkdgetvdyevvetrhgpivsefasesgkdtvlslrwtaldasteleaimemnratgweefeqglekflvpaqnfvfasndgtiaykangkipiyedgqdallplngweaesewqgyipydelptvinpekgfiatannqiapdsypyhisnvwaqpyryeriaevlesgdnftaedmqdlqmdqtdlrarefvpifqkvledtelteqekealdalsewdfvadkdapqplifehwmqaiqstiyqqeipqvmrelfstqsqstenvlrkaasgqksqwiedkggievvlhdalentmekltetygedlsawkwgdyhqvqfhhplssvspllafflnnedaipvggsgvtpmatsydketgevdhgaswrfvidtsdmqsgyhivgpgqdghfrsdwyhdqmndwvegnfhetrldgaegeelvlepge(seq id no:1)。

5、优选地，所述突变体为选自下述的多肽：

6、(a)氨基酸序列为seq id no:3的多肽；

7、(b)氨基酸序列与seq id no:3有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且酶活力相比seq id no:3提高的多肽；

8、(c)氨基酸序列与seq id no:3有90％以上、优选92％以上、优选95％以上、优选97％以上、优选98％以上、更优选99％以上同源性、且s/h值(合成产物/水解产物比值、合成/水解比值)相比seq id no:3提高的多肽。

9、所述突变体是野生型青霉素酰胺酶的q208e、l285a、a411v、s698g突变体，其氨基酸序列为seq id no:3：

10、mgerqreqvsqpkkkrrirtkkillgglgsifllaliaflfvngyinkslpqtegtmelpmldnevtvitdedgvphiqaetardmyiaqgyiqadrrmfqmelsrrqasgtlsevvgedalnqdkyfrtlglrraaeksyevyseesvevlewfstgvnaymeeakannslpveftlmdfepeewtpvdsltigkfmafdlgghwqeqafnyylldnyeqekayelfpsypenkptiiqdeeidiaasfehaviphpfngsnnwvvsgdktasgmplladdphaglatpsiwlqmhlesgdglnvsgvifagvpgiilghneqiawgvtntgpdvqqlyieqrnpdnpheflfedeweeatvmeepikvkdgetvdyevvetrhgpivsefasesgkdtvlslrwtaldvsteleaimemnratgweefeqglekflvpaqnfvfasndgtiaykangkipiyedgqdallplngweaesewqgyipydelptvinpekgfiatannqiapdsypyhisnvwaqpyryeriaevlesgdnftaedmqdlqmdqtdlrarefvpifqkvledtelteqekealdalsewdfvadkdapqplifehwmqaiqstiyqqeipqvmrelfstqsqstenvlrkaasgqksqwiedkggievvlhdalentmekltetygedlsawkwgdyhqvqfhhplsgvspllafflnnedaipvggsgvtpmatsydketgevdhgaswrfvidtsdmqsgyhivgpgqdghfrsdwyhdqmndwvegnfhetrldgaegeelvlepge(seq id no:3)。

11、在一种优选的实施方式中，上述酶催化反应温度为10～20℃，优选12-18℃，更优选15℃左右；反应体系ph值为ph6.0-8.0，优选ph6.2-7.0，更优选ph6.5左右。

12、应理解，本文中在表述数值特征时，术语“左右”或者“大约”是指所表示的本数可以有±10％、±9％、±8％、±7％、±6％或±5％的误差范围或浮动范围。

13、进一步地，上述反应中，所述青霉素酰胺酶或者其突变体除了呈酶形式存在外，还可以呈其表达微生物菌体形式。

14、上述微生物选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母。优选地，所述微生物是大肠杆菌bl21(de3)。

15、本发明第二个方面提供了一种青霉素酰胺酶突变体，其氨基酸序列为seq id no:3。

16、进一步地，本发明还提供了一种编码上述青霉素酰胺酶突变体seq id no:3的基因。

17、例如，上述基因的核苷酸序列可以为seq id no:4。

18、相应地，本发明还提供了一种dna分子，其包含上述的基因比如seq id no:4。

19、本发明另一个方面提供了一种质粒，其包含上述的dna分子。

20、上述的质粒载体可以选自pet系列，比如载体是pet22b、pet24a、pet28a等，但并不受限于此。

21、本发明的另一个方面提供了一种微生物，其表达如上述的编码基因比如seq idno:4。优选是转化了上述质粒的转化子。

22、本发明提供的青霉素酰胺酶突变体seq id no:3具有较高的底物高浓度耐受性，即便在底物7-acca浓度高达15wt％时也没有底物抑制性，可以在ph6.5的体系下催化450mm的7-acca和468mm的d-pgm.hcl快速反应，有利于促进酶法生产头孢克洛的工业化。