用于检测尿液中草酸含量的试剂、试剂盒及方法与流程

本发明涉及草酸检测，具体涉及一种用于检测尿液中草酸含量的试剂、试剂盒及方法。

背景技术：

1、高草酸尿症(hyperoxaluria)是一种草酸代谢紊乱的疾病状态，特征是尿草酸排泄增加。临床上，高草酸尿症的定义为尿液中草酸＞40mg/d。尿草酸作为高草酸尿症的主要标志物，已被写入美国、欧洲、中国、加拿大等全球多数国家的泌尿结石疾病诊断指南，对于复发性草酸钙结石患者，要求进行尿液中草酸排泄量的检测和分析，以诊断疾病原因。但并没有在临床上普遍推广。究其原因，主要是尚没有操作简便且性价比高的商业化试剂盒提供，科研上用的离子色谱等检测方法，操作复杂，普通临床检验人员无法胜任，检测费用昂贵，患者难以接受，故推广困难，因为没有及时对患者的结石发病机理做检测分析，导致结石复发率呈显著上升趋势。

2、高草酸尿症患者尿液中的草酸含量高，高浓度的草酸与尿液中的钙离子形成的草酸钙结晶容易沉淀，导致测定的尿草酸结果偏低，从而存在误诊的风险。因此在临床上，为保证尿液的草酸检测的准确性，大多采用盐酸(0.5-1ml/100ml尿样)等酸化剂，既能溶解尿液中的草酸钙晶体，使得草酸完全释放，也能保证尿液防腐，避免滋生微生物导致检测结果波动。但是盐酸属于危险化学品(强酸)，具有较强的腐蚀性，使用时存在一定安全风险，同时盐酸也是易制毒试剂，收到严格的管控，不易大量购买。另外盐酸酸化后的尿液ph较低，后续样本检测时适用性较差，检测前都需要对尿液进行进一步调节ph处理，增加了检测的繁琐性，不利于检测的自动化操作。

3、目前，科研、临床上测定草酸的方法有比色法、高效液相色谱法、离子色谱法、酶法，现有的方法在使用时，存在以下缺陷：

4、(1)化学比色法是用浓hcl酸化尿标本达ph1～1.8，使草酸钙结晶溶解。取酸化尿采用naoh调ph至7.0，加饱和硫酸钙溶液、无水乙醇，共同沉淀尿中草酸，沉淀的草酸钙溶于稀硫酸，在沸水浴中用锌粒还原草酸成羟基乙酸，后者与变色酸(4，5-二羟基萘2,7二磺酸钠盐)显色。呈色液在570nm有最大吸收，因此，能够根据显色液在570nm出吸收值的情况计算得到样品中草酸的含量。该方法操作复杂，需要hcl、naoh反复调节尿液ph，还需要将尿草酸先进行沉淀然后再溶出以后才能完成检测，沉淀、溶解不完全均会导致草酸测定值偏低。

5、(2)高效液相色谱法，是收集24h尿，按照尿液-浓盐酸(100∶1)酸化尿液。取尿样1ml于带盖离心管中，加入5μl浓盐酸，0.5ml邻苯二胺标准液(10g/l)，旋紧盖子于140℃(采用液体石蜡升温，注意离心管中液体绝不能溢出)加热30min，室温冷却，用5mol/l naoh调节ph 5～6，2 300r/min离心15min，上清液过0.22μm微孔滤膜，取50μl滤液进行色谱分析。以峰面积对质量浓度，进行线性回归，可见在1.953～125mg/l，峰面积与草酸质量浓度呈良好的线性关系。该方法尿液前处理需要先在高温条件下进行衍生化，并且尿液中干扰成分多，色谱分离时很难保证草酸衍生物和其他杂质的基线分离，导致无法对目的峰进行准确积分，进而无法实现准确测定。

6、(3)离子色谱法是使用离子色谱仪dx-80(美国戴安公司生产)，装配有型号为as14a的分析色谱柱，离子色谱法测试24h尿液样本时，搜集24h尿液于聚乙烯瓶中以100∶1(尿液∶浓盐酸)的比例加入浓盐酸使尿液酸化使其ph＜1.0。然后取0.1ml尿液用0.3mmol/l的硼酸溶液以100∶1(硼酸溶液∶尿液)的比例稀释(稀释后尿样的ph值约为2～3)，上清液过0.22μm微孔滤膜，取滤液进行色谱分析。以峰面积对质量浓度，进行线性回归，发现其在0～10μmol/l的范围内也有良好的线性关系。该方法的缺陷在于：一方面该方法线性范围很低，尿液需要进行100倍比例稀释后才在标准曲线范围内，稀释倍数越大，检测误差越大；另一方面，离子色谱系统及色谱柱成本都较高，并且色谱系统每次只能检测一个样品，不能实现高通量检测，因而难以在科学研究与临床检测中的使用。

7、(4)美国trinity公司研发的草酸测试试剂盒采用hrp(辣根过氧化物酶)显色法，通过大麦草酸氧化酶将待测样品中的草酸氧化为二氧化碳和过氧化氢，过氧化氢在hrp作用下与mbth(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone)和dmab(3-(dimethylamino)benzoic acid)反应生成化合物indamine dye，由于indamine dye在590nm处有特征吸收峰，因此，能够根据indamine dye反应前后在590nm处吸收峰的变化值计算得到样品中草酸的含量。24h尿液样本检测时，需要预先加入了10ml 10mol/l浓盐酸的尿液收集容器收集24h的尿液样本。并且样品检测时还需要再次检查ph。该方法的缺陷在于：①该方法中大麦草酸氧化酶的最适ph为3.2，hrp的最适ph为5.0～5.2，两者的最适ph值差别较大，在实际使用时，难以使得大麦草酸氧化酶和hrp均达到较高的活性。②该方法中尿液需要先进行酸化处理，为保证检测时检测条件在草酸氧化酶和hrp的最适ph条件下，样品前处理过程中还需要对处理尿液ph进行检查和调整，保证ph在5.0-7.0，操作麻烦。③该试剂盒需要采用分光光度计上进行完成检测，反应体系要求2-5ml，检测通量低。

8、公开号为cn 104406949 b的发明专利公开了一种荧光染色法。但其存在的缺陷是：①该方法的草酸检测范围是0-100umol/l，远低于正常尿样的草酸范围，尿样按照该方法检测时必须要增加稀释处理。②该方法检测时，由于尿液干扰因素大，必须要将标曲样品加到待测尿液中，然后利用截距法计算待测样本中的草酸含量，每检测一个尿液样本，都需要单独用该尿液样本配制一条标准曲线，在检测过程中操作繁琐，检测通量低。③该试剂盒需要采用的是荧光酶标仪完成检测，在科研及临床应用上该设备比较少，尤其检验科，该方法无法与常用的生化分析仪兼容。

9、基于此，如何提供一种操作简单、成本低、易于推广的尿草酸检测试剂盒及方法具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种用于检测尿液中草酸含量的试剂、试剂盒及方法，采用该试剂及试剂盒进行尿草酸的检测，操作简单、成本低且容易在医疗机构实现批量检测。

2、本发明采用如下技术方案：用于检测尿液中草酸含量的试剂，包括40～120mg/l的4-氨基安替比林、0.1272～1.272g/l的3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、0.6-3.6u/ml的辣根过氧化物酶、0.1-10u/ml的草酸氧化酶，ph4.5-6.5的缓冲液。

3、作为一种优选的实施方式，所述试剂包括60mg/l的4-氨基安替比林、1.272g/l的3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、2.4u/ml的辣根过氧化物酶、0.3u/ml的草酸氧化酶，ph4.5-6.5的缓冲液。

4、作为一种优选的实施方式，所述草酸氧化酶为甜菜草酸氧化酶(含重组甜菜草酸氧化酶)或香蕉草酸氧化酶(含重组香蕉草酸氧化酶)。

5、本发明还提供了一种用于检测尿液中草酸含量的试剂盒，所述试剂盒至少包括尿液稳定试剂和尿液草酸检测试剂；其中，所述尿液稳定试剂包括金属离子螯合剂；所述尿液草酸检测试剂为上述用于检测尿液中草酸含量的试剂。

6、作为一种优选的实施方式，所述试剂盒还包括尿液预处理试剂，所述尿液预处理试剂为活性炭或含有0.2～0.4g活性炭的spe柱(spe柱规格为3～6ml)，所述spe柱由柱套、下筛板和上筛板组成，所述活性炭填充在上筛板和下筛板之间。

7、作为一种优选的实施方式，所述金属离子螯合剂包含edta-2na(乙二胺四乙酸二钠)、edtmp·na5(乙二胺四甲叉膦酸五钠)、egta-2na(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸二钠)或eddha-na(乙二胺二邻苯基乙酸钠)中的至少一种。

8、作为一种优选的实施方式，每24h尿液所需金属离子螯合剂的用量为5～50mmol。

9、本发明还提供了一种用于检测尿液中草酸含量的方法，包括以下步骤：

10、步骤s1，向每升ph 4.5～6.5的缓冲液中加入4-氨基安替比林、3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、辣根过氧化物酶、草酸氧化酶，制备得到权利要求1～2任一项所述的用于检测尿液中草酸含量的试剂；

11、草酸标准物质采用0.1％的proclin300水溶液配制成草酸标准品，浓度为0～1.0mm；

12、准备活性炭-spe柱；

13、步骤s2，将装有尿液稳定试剂的收集桶中收集的24小时尿液，取2ml加入到活性炭-spe柱中进行过滤，收集得到待检样品；

14、步骤s3，取草酸标准品及净化后的待检样品，加入上述制备得到的用于检测尿液中草酸含量的试剂，混匀，在15～40℃孵育10～60min，在显色液的检测波长下读取草酸标准品及净化后待测样品的吸光度值；

15、步骤s4，通过比较待测样品和草酸标准品的吸光度值确定样品中的草酸含量，或者，通过草酸标准曲线计算待测样品中草酸含量。

16、作为一种优选的实施方式，检测时的波长为490-520nm。

17、作为一种优选的实施方式，步骤s3中使用酶标仪、分光光度计或生化分析仪进行检测。

18、与现有技术相比，本发明的核心效果在于：

19、(1)本发明所提供的用于检测尿液中草酸含量的试剂、试剂盒及方法，收集后的尿液不需要任何复杂处理，可直接经过活性炭-spe柱过滤，收集滤液后直接进行检测，且检测范围为0～1mmol/l，能涵盖从正常人到高草酸尿症患者尿液中的草酸浓度范围，不需要稀释就正好在检测范围内，准确率更高，回收率在90～110％之间，结果可靠；

20、(2)使用含有金属离子螯合剂的尿液稳定试剂，相比于尿草酸检测时常用的盐酸作为防腐剂，成分安全、易购买，使用时不会带来安全隐患；且该稳定试剂在不改变尿液ph的条件下，可以实现草酸钙晶体中的草酸释放，后续无需进一步的ph调节，可直接进行草酸测定；稳定试剂基本不改变尿液ph，收集后的尿液除了用于草酸检测外，还可直接用于尿酸(尿酸在低ph容易析出，盐酸做稳定剂和防腐剂时，草酸检测和尿酸检测无法使用同一份尿液样品)、尿柠檬酸、尿磷、尿肌酐等指标的测定；该稳定试剂可兼顾尿液防腐的效果，可在常温、2～8℃保存至少2周，可在-20℃长期保存；

21、(3)使用活性炭-spe柱做尿液净化处理，实现活性炭吸附和过滤同步操作，尿液经活性炭-spe柱一步过滤收集滤液就可以进行检测，与现有技术trinity草酸试剂盒中需要尿液与缓冲液混合后，将ph调节至5～7，然后再加入到活性炭管中涡旋5min，离心取上清检测，以及高效液相色谱草酸还需要衍生化后检测相比，本发明操作步骤简单，并且可配合抽滤装置使用，实现高通量、自动化的样本处理，医疗机构的可接受性好；

22、(4)用于检测尿液草酸含量的方法检测体积更小、通量更高。对比trinity试剂盒采用分光光度计设备，反应体系需要2～5ml，本发明的方法反应体积只有trinity试剂盒的10％以下，更节约试剂；对比trinity采用的分光光度计设备，一次只能检测一个样本，本发明的尿草酸检测试剂及试剂盒，除兼容分光光度计外，还可采用的是酶标仪和生化分析仪，检测通量更高，自动化程度更高，更容易在医疗机构实现批量检测，快速诊断高草酸尿症疾病。