一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含Sn-2位DHA藻油中的应用的制作方法

本发明属于生物工程，具体涉及一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含sn-2位dha藻油中的应用。

背景技术：

1、二十二碳六烯酸又被称为dha，分子式为c22h32o2，属于ω-3系列不饱和脂肪酸。dha在人体内主要分布在大脑灰质、神经系统、视网膜系统、心肌、嗜酸性白细胞和母乳等处，具有重要的生理功能。研究表明dha在sn-2位的特殊结构甘油三酯更利于人体吸收，甘油三酯结构的油脂经胰腺脂肪酶分解后，sn-1、sn-3位脂肪酸形成游离的脂肪酸，难以渗入胆盐微胶粒被人体吸收，从而容易与肠道中钙、镁离子结合形成不溶性的皂盐损失掉；而sn-2位脂肪酸形成单甘油酯，易渗入胆盐微胶粒被人体吸收，所以sn-2位脂肪酸比sn-1、sn-3位脂肪酸具有更高的人体吸收率。

2、裂殖壶菌(schizochytrium)又称裂壶藻，属于网粘菌门、网粘菌纲、破囊壶菌目、破囊壶菌科的一类海洋真菌，因其生长速度快、易于培养等特点，被广泛应用于科研和商业生产。目前，微生物法获取dha的主要来源是利用裂殖壶菌高密度发酵培养,其体内可积累大量脂肪，且70％以甘油三酯形式存在,其中dha可以占到总脂肪酸的45-55％。

3、目前微生物来源的dha油脂的甘油骨架上的分布比例是sn-2位的含量，远远低于sn-1、sn-3位的含量，大量sn-1、sn-3位dha在人体消化过程中形成皂盐而损失，微生物油脂的保健功效受到了限制。为提高人类对dha藻油的利用率，本发明生产出一种富含sn-2位dha藻油，相较与普通商品化藻油与天然dha更相似，提高了藻油中sn-2位上dha的含量，更容易被人类肠道黏膜吸收入。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含sn-2位dha藻油中的应用，以解决背景技术中的问题。

2、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

3、一株裂殖壶菌(schizochytrium sp.)tkd-2212，所述裂殖壶菌已于2022年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址位于中国-武汉-武汉大学，保藏编号为cctccno.m20221978。

4、裂殖壶菌菌落及细胞形态：裂殖壶菌(schizochytrium sp.)tkd-2212在海水培养基上，25℃培养7天，菌落直径为3-5mm，白色，后期为浅褐色；菌体壁薄，球形，透明，菌体直径为6.0-18.2μm。

5、裂殖壶菌rrna基因序列测定结果(18srrna序列片段)：

6、>rrna_scaffold34_21600-23382_dir+/molecule＝18s_rrna/score＝1330.9

7、atctggttgatcctgccagtagtcatatgctcgtctcaaagattaagccatgcatgtgtaagtataagcgattgtactgtgagactgcgaacggctcattatatcagtaataatttcttcggtagtttcttttatatggatacctgcagtaattctggaaataatacatgctgtaagagccctgtatggggctgcacttattagaatgaagccgattttattggtgaatcatgataattgagcagattgacatttttgtcgatgaatcgtttgagtttctgccccatcagttgtcgacggtagtgtattggactacggtgactataacgggtgacggagagttagggctcgactccggagagggagcctgagagacggctaccatatccaaggatagcagcaggcgcgtaaattacccactgtggactccacgaggtagtgacgagaaatatcgatgcgaagcgtgtatgcgttttgctatcggaatgagagcaatgtaaaaccctcatcgaggatcaactggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccagaagcatatgctaaagttgttgcagttaaaaagctcgtagttgaatttctggcatgggcgaccggtgctttccctgaatggggattgattgtctgtgttgccttggccatctttctcatgctttattggtatgagatctttcactgtaatcaaagcagagtgttccaagcaggtcgtatgaccggtatgtttattatgggatgataagataggacttgggtgctattttgttggtttgcacgcctgagtaatggttaataggaacagttgggggtattcgtatttaggagctagaggtgaaattcttggatttccgaaagacgaactagagcgaaggcatttaccaagcatgttttcattaatcaagaacgaaagtctggggatcgaagatgattagataccatcgtagtctagaccgtaaacgatgccgacttacgattgttgggtgcttattaatgggcctcagcagcagcacatgagaaatcaaagtctttgggttccggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccaccaggagtggagcctgcggcttaatttgactcaacacgggaaaacttaccaggtccagacataggtaggattgacagattgagagctctttcatgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctggttaattccgttaacgaacgagacctcggcctactaaatagtgcgtggtatggcaacatagtgcgtttttacttcttagagggacatgtccggtttacgggcaggaagttcgaggcaataacaggtctgtgatgcccttagatgttctgggccgcacgcgcgctacactgatgggttcatcgggttttaattctgtttttatggaattgagtgcttggtcggaaggcctggctaatccttggaacgctcatcgtgctggggctagatttttgcaattattaatctccaacgaggaattcctagtaaacgcaagtcatcagcttgcattgaatacgtccctgccctttgtacacaccgcccgtcgcacctaccgattgaacggtccgatgaaaccatgggatgtttctgtttggattgatttttggacagaggcagaactcgggtgaatcttattgtttagaggaaggtgaagtcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcatta。

8、一株裂殖壶菌及其在发酵生产富含sn-2位dha藻油中的应用，包括如下步骤：

9、步骤一：采用富含sn-2位dha藻油的裂殖壶菌活化后得到裂殖壶菌种子液；

10、步骤二：将裂殖壶菌种子液经过一级种子罐扩大培养和二级种子罐扩大培养后进行三级发酵，生产出裂殖壶菌发酵液；

11、步骤三：采用酶法对裂殖壶菌发酵液进行破碎处理后经过萃取处理得到粗dha藻油；

12、步骤四：粗dha藻油再经酸化脱胶和脱臭处理制得精炼dha藻油；

13、步骤五：dha藻油经过醇解及溶剂萃取纯化后得到富含sn-2位dha藻油。

14、进一步地，步骤一筛选菌种的方法为：从自然环境中经筛选、诱变、选育，获取裂殖壶菌，进行全基因测序后进行定向驯化，筛选出裂殖壶菌(schizochytrium sp.)tkd-2212菌种后加甘油封存，在-80℃条件下保存。

15、活化方法为：将所述裂殖壶菌按照8％接种量接种至种子培养基中，30℃恒温培养36h得到藻种，在从种子培养基中按照5％接种量接种至发酵培养基中，控制温度为30℃、转速180rpm培养得到种子液。所述种子培养基的制作过程包括：葡萄糖10g/l，酵母粉15g/l，蛋白胨5g/l，ph为6.5～7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。所述发酵培养基的制作过程包括：葡萄糖40g/l，酵母粉15g/l，蛋白胨5g/l，ph6.5～7.0，115℃高压蒸汽灭菌30min。

16、进一步地，步骤二中发酵温度控制为20℃-28℃、转速为160-200rpm,使用3l种子罐进行进行发酵，发酵过程中发酵体系葡萄糖浓度低于5g/l时开始以0.8-1.2g/l/h速度流加高浓度葡萄糖补充碳源。

17、进一步地，步骤三中使用比酶活为3.5×105u/g的碱性蛋白酶,该酶为胞外酶，培养简单，产量大，适用于大规模生产应用。

18、酶法破碎和萃取方法为：在50℃-60℃、ph 9-10条件下使用1.5％-2.5％的碱性蛋白酶破碎裂殖壶菌发酵液，搅拌3h-5h。酶解后的发酵液加入等体积的正己烷常温搅拌2h-3h，高速离心分离(6000rpm，5min)。沉淀用正己烷重复萃取2-3次，合并上清油相为藻油与正己烷混合液。混合液进行减压蒸发(50-55℃、-2.8～1.2kpa)将正己烷蒸出，得到富含dha的粗藻油。

19、进一步地，步骤四中使用85％磷酸可以把磷脂和磷脂金属复合物转化成水化磷脂从而有效降低油脂中胶质和微量金属含量。

20、酸化脱胶和脱臭方法为：在300～400pa真空罐中添加初级藻油质量0.1％-0.3％的磷酸(质量浓度85％)，搅拌15min(60rpm),静置15min后离心分离(6000rpm，10min)，脱去藻油中胶类物质和醛酮类物质，收集上清液得到富含dha的精炼藻油。

21、进一步地，步骤五中使用的固定化脂酶是酰基水解酶lipozyme rm im(丹麦诺维信公司)，该酶为sn-1,3特异性脂肪酶，其在藻油酶解反应中可以保留sn-2位的dha，而将sn-1位和sn-3位的脂肪酸水解为游离脂肪酸，进而富集得到较多的sn-2位的dha；乙醇和正己烷溶剂萃取纯化后可得到高纯度的sn-2位dha藻油。

22、富集sn-2位dha藻油具体方法如下：无水乙醇添加量为dha藻油质量的3～5倍，混合后添加藻油质量8～12％的固定化脂肪酶，在温度25～35℃、搅拌转速为300～400rpm条件下反应8～10小时，反应结束将固定化脂肪酶离心过滤分离(5000rpm,10min)，上清液旋转蒸发除去乙醇，得到的藻油富含sn-2位dha。醇解反应生成产物中除sn-2位dha单甘酯外还含较多的脂肪酸乙酯，采用溶剂萃取方式进行纯化：藻油用85％的乙醇溶液溶解(藻油与乙醇体积比为1：10)，然后用与乙醇溶液等体积的正己烷洗涤乙醇体系三次，取乙醇相，旋转蒸发除去乙醇后即为富含sn-2位dha单甘酯的藻油。

23、本发明的有益效果是：本方法选育出一种裂殖壶菌tkd-2212，在经过一、二级扩大培养、三级发酵后实现dha的高产率；利用sn-1,3位酰基特异性选择脂肪酶对脱胶、脱臭后的藻油进行醇解反应，降低非sn-2位脂肪酸含量，利用非水相(无水乙醇)条件减少sn-2位dha向sn-1和sn-3位的迁移，结合溶剂萃取纯化，实现藻油中sn-2位dha的富集。

24、当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。