一种囊泡及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种囊泡及其应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡(extracellular vesicles,evs)是细胞分泌的含有蛋白质、核酸及各种细胞因子的纳米级载体。细胞外囊泡可以通过内分泌或旁分泌的方式作用于靶细胞，在细胞间物质传递和信息交流过程中发挥了重要作用。研究发现，细胞外囊泡所介导的信息交流在机体生理或病理过程中发挥了重要的调控作用，涉及到免疫调节、肿瘤生长、血管生成、损伤修复等。目前该领域的研究主要集中在外泌体(exosomes)方向。外泌体是直径在30-150nm左右的细胞外囊泡，其内含有rna、脂质和蛋白质等成分。外泌体广泛参与了机体的各种生理/病理性调控，能够用作多种疾病的诊断、治疗和预后评估。迄今为止，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)被认为是产生外泌体能力最强的细胞。众多的研究发现mscs来源的外泌体能模拟mscs的生物学功能，在促进细胞生长和分化，修复组织缺损等方面发挥了重要的调控作用。因此，近年来以mscs来源的外泌体为基础的细胞囊泡疗法取得了显著的发展。然而，目前以外泌体为基础的细胞囊泡治疗仍然存在诸多问题，主要表现在外泌体的提取和纯化过程复杂，耗时长，对设备和试剂的要求较高，生理性外泌体产量较低等等，这些缺陷都限制了外泌体治疗的临床转化和应用。

2、血友病(hemophilia)为一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障碍，凝血时间延长，终身具有轻微创伤后出血倾向，重症患者没有明显外伤也可发生“自发性”出血。2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，血友病被收录其中。血友病主要分为三类，即血友病a，血友病b和血友病c。血友病a，即因子ⅷ促凝成分(ⅷ：c)缺乏症，是一种性联隐性遗传疾病，女性传递，男性发病。血友病b，即因子ⅸ(fix)缺乏症，亦为性联隐性遗传，其发病数量较血友病a少。血友病c，即因子ⅺ(fⅺ)缺乏症，为常染色体不完全隐性遗传，是一种罕见的血友病。发病率以血友病a最多占80％-85％，血友病b占15％-20％，血友病c很少见。长期以来，针对血友病的治疗，临床上以注射外源性凝血因子做为主要干预措施，但该方法存在治疗成本高、治疗有效期短、易产生自身抗体等各种问题，无法成为切实有效的治疗手段。

技术实现思路

1、一些实施方案中，本发明提供了一种来源于间充质干细胞的囊泡。

2、一些实施方案中，本发明提供了一种囊泡组合物。

3、一些实施方案中，本发明提供了一种针对血友病的、包含囊泡的药物组合物。

4、一些实施方案中，本发明提供了一种囊泡的筛选或者鉴定或者提取试剂盒。

5、一些实施方案中，本发明提供了一种囊泡的标志物。

6、一些实施方案中，本发明提供了一种利用标志物对囊泡进行鉴定或者选择的方法。

7、一些实施方案中，本发明提供了一种囊泡的制备方法。

8、一些实施方案中，本发明提供了一种来源于体细胞或干细胞的囊泡，所述囊泡是诱导性囊泡，所述囊泡具有的标志物包括syntaxin 4。

9、在一些实施方案中，所述干细胞包括全能干细胞和多能干细胞。在一些实施例中，所述干细胞包括间充质干细胞和诱导性多能干细胞(ips)。

10、一些实施方案中，所述的体细胞包括成骨细胞系。

11、一些实施方案中，所述细胞可以是原代培养的细胞，也可以是已有的或已确立的细胞系。

12、一些实施方案中，所述细胞系指的是是指永生化的细胞培养物，在适当的新鲜培养基和空间下可以无限增殖。

13、一些实施方案中，所述细胞可以是确立细胞株。

14、一些实施方案中，所述诱导性囊泡是在所述干细胞或体细胞处于正常存活期间通过外力诱导凋亡而产生的囊泡。

15、一些实施方案中，所述诱导性囊泡是通过添加星形孢菌、紫外线照射、饥饿法、或热应力法或其中一种或多种的组合诱导干细胞或干细胞凋亡产生。

16、一些实施方案中，所述囊泡具有的标志物还包括annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha5中的一种或几种。

17、一些实施方案中，所述囊泡具有标志物syntaxin 4、annexin v、flotillin-1、cadherin 11和integrin alpha 5的组合。

18、一些实施方案中，所述囊泡高表达标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4。

19、一些实施方案中，所述囊泡对标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4的表达量高于msc或外泌体。

20、一些实施方案中，所述囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1-2倍、2-3倍、1-3倍、3-4倍和3-6倍。

21、一些实施方案中，所述囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1.5-2倍、2.5-3倍、1.5-2.5倍、3.5-4倍和3.5-5倍。

22、在一些实施例中，所述囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1.5-1.9倍、2.5-2.9倍、1.8-2.5倍、3.5-3.9倍和4-5倍。

23、一些实施方案中，所述囊泡中的标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4的表达量相对于来源于间充质干细胞的外泌体中标记物的表达量分别为1.76倍、2.81倍、2.41倍、3.68倍和4.45倍。

24、一些实施方案中，所述外泌体不表达syntaxin 4，本发明的囊泡表达syntaxin 4。

25、一些实施方案中，所述外泌体不同时表达annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4，本发明的囊泡同时表达annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4。

26、一些实施方案中，所述囊泡和所述外泌体来源于同种来源的mscs。

27、一些实施方案中，利用流式细胞技术对ievs的表面膜蛋白进行分析，结果显示，mscs来源的ievs能够表达和mscs相似的表面蛋白，即cd29,cd44,cd73,cd166阳性，cd34,cd45阴性；同时，ievs能够表达细胞外囊泡的普遍性表面蛋白cd9,cd63,cd81和c1q。

28、一些实施方案中，所述诱导性囊泡是通过添加星形孢菌素、紫外线照射、饥饿法、热应力法或其组合诱导间充质干细胞凋亡产生。

29、一些实施方案中，所述的囊泡是用星形孢菌素诱导间充质干细胞产生的。

30、一些实施方案中，所述间充质干细胞的代数可以为第2～5代，但又不限于此。

31、一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为1nm-10000nm。一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为100nm-10000nm。一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为500nm-10000nm。一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为500-1000nm。一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为500-900nm。一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为500-800nm。

32、一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.03-6μm。一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.03-4.5μm。一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.03-1μm。一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.04-1μm。一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.05-1μm。一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.1-1μm。一些实施方案中，所述囊泡的直径为0.15-1μm。

33、一些实施方案中，本发明还提供了一种囊泡组合，包含上述囊泡。

34、在一些实施方案中，所述囊泡组合还包含其他现有技术中的囊泡，包括但不限于如外泌体、迁移体、微泡和ectosome。

35、在一些实施方案中，其中所述的囊泡在所述囊泡组合物中的数目占比为65-100％。

36、一些实施方案中，所述的囊泡在所述囊泡组合物中的数目占比为75-98％。

37、一些实施方案中，所述的囊泡在所述囊泡组合物中的数目占比为80-96％。

38、一些实施方案中，本发明还提供了一种组合物，所述药物组合物包含上述囊泡或者上述囊泡组合。

39、一些实施方案中，所述组合物包括药品、食品、保健品、化妆品、添加剂或中间品。

40、一些实施方案中，所述组合物为药品。

41、一些实施方案中，所述组合物还包含药学上或免疫学上可接受的载体。

42、一些实施方案中，所述组合物的制剂形式选自冻干粉针、注射剂、片剂、胶囊、试剂盒或贴剂。

43、一些实施方案中，所述囊泡是作为一种药物载体使用。

44、一些司机是方案中，本发明还提供了一种所述囊泡的筛选或者鉴定或者提取试剂或试剂盒，包含以下标志物检测试剂中的一种或多种：标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4的检测试剂。

45、一些实施方案中，所述标志物的检测试剂检测所述标志物基因的表达量。

46、一些实施方案中，所述标志物的检测试剂检测所述标志物mrna的表达量。

47、一些实施方案中，所述标志物的检测试剂检测所述标志物蛋白的表达量。

48、一些实施方案中，所述标志物的检测试剂为荧光定量pcr染料、荧光定量pcr引物、荧光定量pcr探针、抗体、抗体功能性片段和偶联抗体中的一种或多种。

49、一些实施方案中，所述试剂盒选自qpcr试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒和elisa试剂盒中的一种或多种。

50、一些实施方案中，所述试剂盒选自流式细胞分析试剂盒。

51、一些实施方案中，本发明还提供了所述囊泡或所述的囊泡组合物或所述的药物组合物在制备治疗或预防或改善疾病或所述疾病并发症的产品中的应用；所述疾病包括肝病、血友病。

52、一些实施方案中，所述疾病为血友病，所述的囊泡能够在体外发挥显著的促凝作用，体内注射后能够显著改善血友病小鼠的出血倾向，可用于改善血友病出血倾向的治疗，具有良好的应用前景。

53、一些实施方案中，所述疾病为血友病a。

54、一些实施方案中，所述产品包括药品、食品、保健品、化妆品、添加剂或中间品。

55、将所述囊泡用于疾病治疗的过程中，可以将所述囊泡任选地通过选自由静脉内注射、肌肉注射、皮下注射、鞘内注射或输注以及器官内输注所组成的组中的途径进行给药。例如，作为例子，对于静脉注射，可以通过尾静脉注射。器官内输注包括输注至解剖学空间中，例如，作为例子，胆囊、胃肠腔、食道、肺系统(通过吸入)和/或膀胱。

56、作为例子，对于胃肠腔输注中腹腔注射，与尾静脉注射相比，腹腔注射也可以获得同等的治疗效果。腹腔注射的安全性和可操作性要优于尾静脉注射。

57、一些实施方案中，本发明还提供了一种选择或鉴定所述囊泡的方法，所述方法包括对以下标志物中的一种或多种进行检测：标志物annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4。

58、当检测结果显示所述标志物阳性结果时，则判别为所述囊泡。

59、在一些实施方案中，可以将所述标志物的表达结果与对照相比，当表达量显著高于对照时，判断为阳性结果。所述的对照可以是现有其他囊泡或者外泌体(可以包括外泌体、迁移体、微泡和ectosome中的一种或几种)；可以是来源于间充质干细胞的其他囊泡或者外泌体。

60、在所述的标志物中，尤其优选标志物syntaxin。在一些实施方案中，当所测囊泡的syntaxin 4表达量大于或等于外泌体(例如同种细胞来源的外泌体)的2-6倍(更优选4-5倍)时，判断为所述的囊泡(例如诱导性囊泡)。

61、在一些实施方案中，本发明提供了所述标志物的检测试剂在制备检测或鉴定所述囊泡的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述标志物包括annexin v、flotillin-1、cadherin 11、integrin alpha 5和syntaxin 4中的一种或多种，所述试剂或试剂盒还包括对照试剂，所述对照试剂包含外泌体、迁移体、微泡和ectosome中的一种或几种，当所述待测样品中的所述标志物的表达量高于对照试剂时，则判断为阳性。

62、一些实施方案中，所述对照试剂为外泌体。

63、一些实施方案中，当所述待测样品中的syntaxin 4表达量大于或等于外泌体的2-6倍时，则判断为所述囊泡。

64、一些实施方案中，当所述待测样品中的syntaxin 4表达量大于或等于外泌体的4-5倍时，则判断为所述囊泡(例如诱导性囊泡)。

65、在一些实施方案中，本发明提供了一种制备所述囊泡的方法，包括以下步骤，所述方法为通过添加凋亡诱导剂诱导干细胞或体细胞产生所述囊泡。

66、一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(1)培养间充质干细胞；(2)收集间充质干细胞的培养基上清；(3)从步骤(2)中的培养基上清中分离出囊泡。

67、一些实施方案中，步骤(1)中的培养间充质干细胞的步骤包括：(4)从组织中分离间充质干细胞；(5)添加培养基培养间充质干细胞；所述间充质干细胞的培养基中接触凋亡诱导剂。

68、一些实施方案中，所述凋亡诱导剂包括星形孢菌素、紫外线照射、饥饿法、或热应力法或其中一种或多种的组合。

69、一些实施方案中，所述凋亡诱导剂为星形孢菌素。

70、一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为500-1000nm。一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为500-900nm。一些实施方案中，所述星形孢菌素的浓度为500-800nm。

71、一些实施方案中，步骤(5)中凋亡诱导剂的处理细胞的时间为16-24小时。

72、一些实施方案中，所述步骤(3)中，分离囊泡的方法包括选用超速离心的方法分离所述囊泡。

73、一些实施方案中，本公开中单个mscs能够产出300-2000个囊泡。

74、一些实施方案中，所述超速离心的方法分离所述囊泡的步骤包括：(a)将收集到的培养上清进行第一次离心，取上清；(b)将步骤(a)中收集到的上清进行第二次离心，取上清；(c)将步骤(b)中收到到的上清进行第三次离心，取沉淀；(d)将步骤(c)中收到到的沉淀进行第四次离心，取沉淀；(e)将步骤(d)中收到到的沉淀进行第五次离心，取沉淀；

75、一些实施方案中，所述第一次离心为500-1500g离心5-30分钟。一些实施方案中，所述第一次离心为500-1000g离心5-20分钟。一些实施方案中，所述第一次离心为500-900g离心5-15分钟。一些实施方案中，所述第二次离心为1000-3000g离心5-30分钟。一些实施方案中，所述第二次离心为1500-2500g离心5-20分钟。一些实施方案中，所述第二次离心为1500-2200g离心5-15分钟。一些实施方案中，所述第三次离心为10000-30000g离心15-60分钟。一些实施方案中，所述第三次离心为12000-25000g离心20-60分钟。一些实施方案中，所述第三次离心为12000-20000g离心20-40分钟。一些实施方案中，所述第四次离心为10000-30000g离心15-60分钟。一些实施方案中，所述第四次离心为12000-25000g离心20-60分钟。一些实施方案中，所述第四次离心为12000-20000g离心20-40分钟。

76、一些实施方案中，带有特定标记物的囊泡，可以通过针对特定标记物的富集方法富集获得。在得到足够的囊泡后，收集培养基并从培养基中纯化和分离特定的囊泡。这可以通过本领域已知的任何合适的方法来实现。这些方法包括，例如，通过差异超速离心分离外泌体的原始方法，以及更新的方法，例如聚合物沉淀(来自sbi，palo alto，ca的exoquicktm)、免疫亲和捕获(greening等人2015，methods in molecular biology)、免疫磁捕获(exo-flowtm，sbi)等。

77、免疫亲和纯化是基于表面标志物选择性捕获特定囊泡的方法。通过链霉亲和素共价包覆的磁珠和生物素化的捕获抗体之间高亲和力的偶联，实现囊泡的高效捕获。所捕获的囊泡经洗脱后，结构完整且具有生物活性。基于本发明的发现，所述囊泡能特异性高表达annexin v，flotillin-1，cadherin 11，integrin alpha 5和syntaxin 4分子，那么本发明可以使用该方法对囊泡进行分离或纯化或富集。

78、一些实施方案中，还可以使用免疫磁珠的方法对所述囊泡进行富集，所述免疫磁珠是由单克隆抗体与磁珠偶联得到的；所述单克隆抗体包括anti-syntaxin 4抗体、anti-annexin v抗体、anti-flotillin-1抗体、anti-cadherin 11抗体、anti-integrin alpha 5抗体中的一种或多种。

79、当在本技术中使用术语“富集”时，它涵盖了一个或多个囊泡从存在于样品中的任何其它囊泡中的分离或者其是指包含囊泡的组合物中所述囊泡以更高的总百分比含量存在，与发现其存在生物体的组织中时相比。

80、在一种实施方式中，被富集的囊泡不从样品中分离，而是在囊泡仍存在于样品中时对囊泡进行任何诊断。所述样品则可呈现在载玻片上，并可使用显微镜进行诊断，并且在此实施方式中囊泡被检测而不被分离。

81、在一些实施方案中，本发明还提供了一种诱导性囊泡，该诱导性囊泡来源于ips细胞。其是在ips细胞处于正常存活时，进行干预或诱导，使ips细胞凋亡产生的一类亚细胞产物。

82、在另外一种实施方式中，被富集的囊泡从样品中分离。

83、其中，免疫磁珠分离技术(immunomagneticbead-basedseparation，ims)是近年来发展起来的一项新的免疫学技术。免疫磁珠(immunomagneticbead，imb)既可结合活性蛋白质抗体，又可被磁铁吸引，经过处理后，可将抗体结合在磁珠上，使之成为抗体的载体，磁珠上抗体与特异性抗原物质结合后，则形成抗原-抗体-磁珠免疫复合物，这种复合物在磁力作用下发生力学移动，使复合物与其它物质分离，而达到分离特异性抗原的目的。免疫磁珠(imb)是一个平台，凡是利用抗原抗体结合原理进行工作的领域都可以应用，并且已在医学和生物学的骨髓移植、分离干细胞、细胞器、癌细胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得了显著成绩。近年来imb以其高度的敏感性和特异性被广泛应用于食品、水、生物样品、环境等标本中真菌毒素的分离和检测工作中，显示出良好的开发应用前景。

84、本发明所述的免疫磁珠方法是使用有特异性抗体结合的磁珠去和有特异性表面抗原的靶囊泡相结合，再用磁场来吸附，抽取靶囊泡。

85、在本发明的某些具体实施方式中，所述囊泡具体富集方法为，将anti-syntaxin 4抗体、anti-annexin v抗体、anti-flotillin-1抗体、anti-cadherin 11抗体、anti-integrin alpha 5抗体中的一种或多种抗体包被的免疫磁珠加到含有囊泡的细胞培养上清中，那么，与anti-syntaxin 4抗体、anti-annexin v抗体、anti-flotillin-1抗体、anti-cadherin 11抗体、anti-integrin alpha 5中的一种或多种抗体能够特异性结合的囊泡就被分离出来，可以达到富集特定囊泡的目的。一些优选的实施方式中，当使用anti-syntaxin 4抗体、anti-annexin v抗体、anti-flotillin-1抗体、anti-cadherin 11抗体和anti-integrin alpha 5抗体同时包被的免疫磁珠分离出的囊泡其纯度最高，治疗疾病例如血友病a的效果最好。

86、一些优选的实施方式中，是基于离心方法进行了组合优化有效去除了细胞以及细胞碎片等杂物之后的细胞培养上清，然后再将anti-syntaxin 4抗体、anti-annexin v抗体、anti-flotillin-1抗体、anti-cadherin 11抗体、anti-integrin alpha 5抗体中的一种或多种抗体包被的免疫磁珠加到所述的细胞培养上清中，那么，与所述抗体能够特异性结合的囊泡就能够被分离出来，可以达到富集特定囊泡的目的。

87、一些实施方案中，所述间充质干细胞来源于人或鼠，但不限于此。

88、一些实施方案中，所述间充质干细胞包括骨髓来源的间充质细胞、尿液来源的间充质干细胞、口腔来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、胎盘来源的间充质干细胞、脐带来源的间充质干细胞、骨膜来源的干细胞或其组合，但不限于此。

89、一些实施方案中，所述间充质干细胞选自骨髓来源的间充质细胞、脂肪来源的间充质干细胞、脐带来源的间充质干细胞和口腔来源的间充质干细胞。