本发明涉及生物，更具体地说，本发明涉及一种从冷冻三文鱼精巢组织提取高质量多聚脱氧核糖核苷酸的方法。
背景技术：
1、三文鱼(oncorhynchus)又名鲑鱼，其英文释义为“鲑科鱼”，也叫撒蒙鱼或萨门鱼，别称大马哈鱼、北鳟鱼、罗锅鱼等。深海冷水洄游鱼类，侧扁，背部隆起，齿尖锐，鳞片细小，银灰色，产卵期有橙色条纹，主要分布于大西洋、太平洋，黑龙江等地。
2、pdrn(poly deoxy ribo nucleotide)，即“多聚脱氧核糖核苷酸”，诞生于欧洲的一个小渔村，是分子量在50～1500kda的一类dna片段多聚体，其碱基组成与人体dna碱基组成相似度高达98％，不存在免疫原性。pdrn通过激活腺苷a2受体和“补救途径”从dna层面发挥作用，具有抗炎、促进伤口愈合、组织修复和延缓衰老等作用，目前已用于医药、医美和食品等领域。意大利mastelli公司于1952年发现并进行研究，2008年，旗下品牌placentex(婴儿针)上市；2008年，韩国批准pdrn用于组织修复和皮肤移植创伤的治疗。
3、专利cn202011188974提供了一种高效的外用pdrn的制备方法及其应用，其主要流程：1.鱼精巢预处理：室温解冻后清洗，粉碎鱼精巢成浆糊状；2.鱼精细胞收集：流程1得到的样品加入混合盐溶液中室温搅拌，离心得沉淀；3.酶解鱼精细胞中的鱼精蛋白：流程2得到的样品加入混合盐溶液中搅拌,37℃酶解；4.sds除鱼精蛋白，离心获得含鱼精巢dna上清液；5.乙醇沉淀获得鱼精巢dna；6.酶切dna获取pdrn。该方法采取双酶切打断工艺，降低了美拉德反应，但双酶切后需再采用除蛋白和等方法除去双酶，该方法成本高、耗时长、pdrn损耗大需进一步优化。
4、专利cn202110961715提供了从鲑鱼精巢中提取高纯度聚脱氧核糖核苷酸的方法，其主要流程：1.从鲑鱼的精巢中分离出精液和未成熟的精巢区；2.未成熟精巢区域的研磨和稀释；3.hcg(人绒毛膜促性腺激素)处理,用hcg处理稀释液诱导精巢细胞成熟为精子；4.离心并收集沉淀；5.pdrn提取,从收集的精子中提取聚脱氧核糖核苷酸(pdrn)。该方法采用hcg处理鲑鱼未成熟的精子提高活力，但hcg是一种激素其使用后的安全性尚未可知，该方法成本高、耗时长、hcg用于鲑鱼精巢pdrn的安全性待研究。
5、专利cn202211007267提供了一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法及应用，其主要流程为：1.收集大马哈鱼精液，选性成熟的雄性大马哈鱼收集精液；2.离心保留沉淀；3.细胞裂解；4.离心取上清；5.乙醇沉淀；6.干燥；7.干燥物后续处理：溶解和超声破碎。该方法采用收集大马哈鱼新鲜精液获得活性pdrn,其成本和pdrn损耗较高、且易发生美拉德反应影响产品质量。
6、专利cn202210451511提供了多聚脱氧核糖核苷酸及其制备方法其主要流程为：1.试剂准备，提前解冻所需试剂；2.鲑鱼dna模板变性处理：双链dna模板处理为单链dna；3.dna模板中和处理，调节溶液ph准备扩增；4.多重置换扩增得到鲑鱼dna样品；5.dna聚合酶灭活，终止反应；6超声/酶切复合处理鲑鱼dna，获取pdrn样品。该方法采用生物合成技术获得pdrn，但获得的pdrn活性需验证，酶切打断后需再采用除蛋白等方法除酶切的酶，耗时长、成本高，且易发生美拉德反应影响产品质量。
7、然而现有技术仍存在以下缺陷，如：
8、专利cn202011188974提供了一种高效的外用pdrn的制备方法及其应用，该方法采取双酶切打断工艺，降低了美拉德反应，但双酶切后需再采用除蛋白和等方法除去双酶，该方法成本高、耗时长、pdrn损耗大需进一步优化。
9、专利cn202110961715提供了从鲑鱼精巢中提取高纯度聚脱氧核糖核苷酸的方法，该方法采用hcg处理鲑鱼未成熟的精子提高活力，但hcg是一种激素其使用后的安全性尚未可知，该方法成本高、耗时长、hcg用于鲑鱼精巢pdrn的安全性待研究。
10、专利cn202211007267提供了一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法及应用，该方法采用收集大马哈鱼新鲜精液获得活性pdrn,其成本和pdrn损耗较高、且易发生美拉德反应影响产品质量。
11、专利cn202210451511提供了多聚脱氧核糖核苷酸及其制备方法，该方法采用生物合成技术获得pdrn，但获得的pdrn活性需验证，酶切打断后需再采用除蛋白等方法除酶切的酶，耗时长、成本高，且易发生美拉德反应影响产品质量。
12、综上，存在的明显缺陷为无除去rna污染的操作，导致pdrn提取的真正纯度不高，因此，现提出一种从冷冻三文鱼精巢组织提取高质量多聚脱氧核糖核苷酸的方法。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供一种从冷冻三文鱼精巢组织提取高质量多聚脱氧核糖核苷酸的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种从冷冻三文鱼精巢组织提取高质量多聚脱氧核糖核苷酸的方法，该方法具体步骤为：
3、s1：鲑鱼精巢处理匀浆：库取出鲑鱼精巢组织，无菌解冻，无菌水反复清洗，清洗后的精巢组织加入预冷的破碎缓冲液(ph7.8，0.8mol/lnacl，2mm/ledta二钠,精巢组织与破碎缓冲液的比例1：3)低温破碎，低温离心6500rpm～9000rpm)20～30min，弃上清；
4、s2：裂解释放dna：沉淀产物中加入裂解缓冲液(沉淀与裂解缓冲液的比例1：6)，(ph8.05mmtris-hcl，2mol/lnacl，1％sds，2mm/l edta二钠，蛋白酶k10u/ml，rnaase 0.5u/ml)搅拌混匀，37℃裂解10-16小时；
5、具体的，裂解液的配方中：2mm/l edta二钠为螯合剂，螯合溶液中的镁离子等，从而控制dna酶，降低dna的降解；ph8.01％sds沉淀蛋白、破碎细胞同时提高dna酶的反应速率，降低反应时间；ph8.05mmtris-hcl，2mol/lnacl提供好的反应环境，高溶解裂解出的dna；加入rnaase是溶解核酸中的rna，因为醇沉法沉淀的是核酸而pdrn是dna，所以该裂解液提取的dna质量高；裂解时间短则能提高效率节约成本；
6、s3：收集纯化dna：s3.18000r/m低温离心40min取上清；
7、s3.2向s3.1上清液加终浓度5.0mol/lnacl(预冷)和1％sds(预冷)，搅拌混匀，低温离心取上清；
8、具体的，整个提取工艺中的低温离心、溶液的预冷和打断时的冰浴；而由于美拉德反应是吸热反应，温度越高反应越强烈，本工艺温控在4℃，使得美拉德反应的机率极低。
9、s3.3向s3.2上清液加终浓度5.0mol/lnacl(预冷)和1％sds(预冷)，搅拌混匀，再次离心取上清；
10、具体的，纯化液预冷的目的降低美拉德反应和dna的降解提高提取率，高浓度盐溶液增加蛋白质盐析，sds同时除去蛋白质，提高pdrn纯度；
11、s4：沉淀浓缩dna：1:2的体积比例向上述上清液加入预冷无水乙醇，混匀，低温静析沉淀；
12、s5：洗涤dna：用预冷的75％乙醇洗涤步骤4得到的dna沉淀物3次，并干燥；
13、s6：超声打断dna，获取pdrn：1.5mol/lnacl溶解步骤s5得到的dna沉淀物，低温超声打断(400～600w，10～20min)20min，真空冻干得白色固体即为pdrn样品。
14、本发明提出的一种从冷冻三文鱼精巢组织提取高质量多聚脱氧核糖核苷酸的方法具有以下有益效果：
15、1、精巢组织破碎采用低温破碎缓冲液降低dna降解从而减少pdrn损耗提高提取率，同时降低美拉德反应提高产品质量；
16、2、采用该裂解液裂能达到dna酶失活减少dna的降解、蛋白质等沉淀、和提高蛋白酶k活性的目的，缩短裂解时间，节约成本提高经济效益，同时降低美拉德反应提高产品质量；
17、3、采用预冷的高浓度盐溶液和sds纯化dna，能达到降低dna降解和pdrn损耗提高提取率，提高pdrn纯度和降低美拉德反应；
18、4、低温高速离心，缩短时间，降低成本，降低美拉德反应提高产品质量；
19、5、采用物理打断工艺进一步缩短时间，降成本提高经济效益。
20、综上，本发明具有降低dna降解，减少pdrn损耗，提高提取率，提高pdrn质量，难发生美拉德反应，缩短时间，降低成本，提高经济效益的优点。