一种特异性促进Nrf2基因表达的多肽及其应用的制作方法

本发明属于生物，具体涉及一种特异性促进nrf2基因表达的多肽及其应用。

背景技术：

1、当人体达到一定的年纪后，人体的代谢功能和各项系统功能的运行就会变慢，从而导致了人体细胞的更新和复制功能变慢，这就导致了衰老。导致衰老的因素可分为内部因素和外部因素，其中最重要的一个因素就是身体里干细胞的数量在减少。干细胞能够进行广泛的自我更新和扩张，并有可能分化成任何类型的体细胞组织，从而对人体进行修复，以达到抗衰老的目的。干细胞可用于再生医学、重建手术和组织生物工程，并且可以源自各种组织。另外，干细胞是人体各种组织和器官的重要构成部分，其在维持人体的正常功能运行和修复受损组织器官上有着重要的作用。如果某个组织器官内的细胞受损，干细胞就会分化成为该组织器官的细胞对其进行修复；同时干细胞还具有自我更新复制功能。

2、其中，人脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)疗法作为治疗不同疾病的治疗选择而备受关注。由于来自新鲜分离组织的细胞群不足，临床使用前需要进行体外增殖。然而，要获得足够数量的细胞供临床使用，需要进行体外增殖，这可能还会导致细胞老化，直接影响细胞治疗的成功。因此，如何控制人脐带间充质干细胞的质量并选择高质量的细胞进行应用对于细胞治疗具有重要意义。

3、人脐带间充质干细胞自身在培养过程中生长缓慢，如何获得高质量、高产量的人脐带充质干细胞是目前研究的重点方向。虽然研究中提高人脐带间充质干细胞的方法很多，如使用人参皂苷rg1(ginsenoside rg1)来提高干细胞的增殖活性，但其昂贵的价格，限制了其大规模的应用。另外，分离的人脐带间充质干细胞本身容易出现复制衰老，需要进一步的提高人脐带间充质干细胞自身的活性，来提高利用价值。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明的提供一种特异性促进nrf2基因表达的多肽及其应用。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、第一方面，本发明提供一种特异性促进nrf2基因表达的多肽，该多肽的氨基酸序列为：leu-asp-glu-glu-asn-gly-glu-leu。

4、转录调控因子nrf2是调控体内细胞氧化应急反应的关键因子，属于cnc-bzip转录因子家族的核转录因子。它通过调控体内一系列的抗氧化蛋白及解毒保护基因，提高细胞的存活能力，因此nrf2也被称为体内抗氧化、抗细胞衰老及保护细胞活度的总开关。大量的研究表明氧化应急反应是体内许多疾病发生发展的始发或关键因素。nrf2通过调控氧化应急反应与糖尿病、肿瘤、肝脏疾病、肾脏疾病、呼吸系统疾病、神经系统疾病、皮肤疾病、代谢性疾病及重金属中毒等人体多种疾病的发生发展有密切的关系。同时，发明人发现，nrf2激动剂本身可以促进人脐带间充质干细胞的增殖，抑制其衰老。

5、本技术通过构建的nrf2激动剂筛选模型，筛选得到特异性促进nrf2的多肽。筛选nrf2激动剂的方法包括：

6、(1)将keap1 kelch结构域克隆到载体的nde i位点和bamh i位点之间，表达并纯化重组的keap1结构域蛋白。

7、(2)高通量筛选反应体系：

8、使用96孔板进行高通量筛选。每个孔的最终体积为200μl，其中包含50μl10nmfitc-nrf2肽和50μl 100nm keap1蛋白。

9、50μl hepes缓冲液作为对照组(amax)；

10、50μl不同浓度的多肽样品作为测试组(aobs)；

11、使用50μl hepes缓冲液替换keap1蛋白，并添加50μl hepes缓冲液作为空白组(amin)；

12、将96孔板以300g离心5分钟，以除去气泡并确保充分混匀。在室温下振荡孵育30分钟，测量前再次离心。使用fp荧光共振法，以485nm为激发波长测定535nm下的荧光强度值。按照下式计算抑制率：

13、抑制率＝((amax-aobs)/(amax-amin))×100％。

14、并使用y＝amin+(amax+amin)/(1+10^(x-logic50))公式进行拟合，计算ic50。

15、其中样品为计算机模拟构建的多肽库。通过高通量筛选，即可获得目标多肽。

16、第二方面，本技术提供一种上述多肽在制备提高人脐带间充质干细胞的生物活性的药物中的应用。

17、本技术提供的上述多肽，能够通过激活nrf2的活性进而有效的促进了人脐带间充质干细胞的增殖，并可以使衰老的人脐带间充质干细胞恢复增殖活力。因此，可以应用在制备用于提高人脐带间充质干细胞的生物活性的药物中，其中，“生物活性”指促进人脐带间充质干细胞的增殖、恢复衰老的人脐带间充质干细胞的增殖活力、延长人脐带间充质干细胞的寿命、促进间充质干细胞的抗衰老能力。

18、第三方面，本技术还提供一种人脐带间充质干细胞的培养基，该培养基中包括上述多肽：leu-asp-glu-glu-asn-gly-glu-leu。

19、进一步地，上述培养基中所述多肽的浓度为100-1000ng/ml。

20、进一步地，上述培养基包括dmem/f12基础培养基以及添加剂；

21、该添加剂包括8-12％的胎牛血清、浓度为100-1000ng/ml的上述多肽。

22、在这一方面的应用中，人脐带间充质干细胞培养在上述培养基中，由于该培养基中含有的上述多肽具有激活nrf2的活性的作用，能够有效的促进了人脐带间充质干细胞的增殖，并可以使衰老的人脐带间充质干细胞恢复增殖活力。从而有效解决现有的培养方法在体外培养人脐带间充质干细胞过程中增殖活性低、细胞老化等问题，有效的控制了人脐带间充质干细胞的质量，并有助于选择高质量的细胞进行细胞治疗。

23、第四方面，本技术提供一种促进人脐带间充质干细胞增殖、活力的培养方法，其包括：

24、(1)将人脐带充质干细胞培养在含有8-12％胎牛血清的dmem/f12培养基，生长至对数期；

25、(2)将对数期的所述人脐带充质干细胞培养液进行消化并处理成细胞悬液；

26、(3)将所述细胞悬液中的人脐带充质干细胞接种于细胞培养板，所述细胞培养板中含有上述培养基，进行增殖培养。

27、进一步地，在上述增殖培养过程中，细胞培养板上接种所述人脐带充质干细胞的密度为1000-3000个/孔，多肽的浓度为100-1000ng/ml，

28、上述增殖培养的条件参数为：

29、培养温度36-38℃，co2浓度为4-6％，湿度为94-96％，培养时间为2-5天。

30、第五方面，本技术提供一种通过上述培养方法获得的人脐带间充质干细胞。

31、本技术通过上述培养方法，培养的人脐带间充质干细胞的细胞活力和增殖能力强，能够保持人脐带间充质干细胞良好的干细胞特性，该培养方法不仅可以用于人脐带间充质干细胞的大规模培养，所得到的人脐带间充质干细胞还可用于细胞疗法或抗衰老美容产品中，应用前景广阔。

32、第六方面，本技术提供一种上述人脐带间充质干细胞在制备具有抗衰老作用的化妆品中的应用。

33、第七方面，本技术提供一种特异性促进nrf2基因表达的多肽在制备用于预防皮肤衰老的组合物中的应用，该多肽的氨基酸序列为：leu-asp-glu-glu-asn-gly-glu-leu。

34、与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

35、本技术通过构建nrf2激动剂的筛选模型，筛选得到特异性激活nrf2的活性肽pep-129，该多肽通过激活nrf2的活性，有效保护脐带间充质干细胞免受氧化应激和各种内外源性有毒物质的损伤，进而有效的促进了人脐带间充质干细胞的增殖。同时，实验发现，该多肽还能使传代衰老的人脐带间充质干细胞恢复增殖能力，例如使p10代细胞增殖能力相较于p5代恢复至93.5％。此外，采用含有pep-29培养的人脐带间充质干细胞，具有较好的抗氧化活性，可发挥抗衰老效果，应用于制备具有抗衰老作用的化妆品或药物组合物中。