一种合成以3-羟基肉豆蔻酸为次级脂肪酸链的类脂A的重组大肠杆菌

本发明涉及一种合成以3-羟基肉豆蔻酸为次级脂肪酸链的类脂a的重组大肠杆菌，属于基因工程与合成生物学领域。

背景技术：

1、细菌的细胞膜在其生存和适应各种环境中起着至关重要的作用。它作为最外层的保护层，保护细菌细胞免受外部威胁，如物理损伤、化学毒素和宿主生物的免疫反应。革兰氏阴性菌的外膜由内小叶的甘油磷脂和外小叶的脂多糖(lps)组成。脂多糖可以作为一种物理屏障或通过特定的外排泵主动去除有毒化合物，从而赋予抗微生物药物的保护作用。完整的lps包含三个不同的元素：疏水性的类脂a，亲水性的核心低聚糖和o抗原。内核心低聚糖，主要由3-脱氧-d-甘露糖醛酸(kdo)组成，与类脂a直接相连，共同形成lps的保守部分。在许多免疫细胞上，toll样受体4/md2复合物可被lps激活，导致先天免疫反应的启动。其中类脂a作为活性中心，是引起免疫反应的主要结构。

2、大肠杆菌的类脂a由葡萄糖胺双糖，以及3-oh c14:0组成的四条脂肪酸链和另外两条二级酰基链c14:0和c12:0构成。在大肠杆菌中类脂a的生物合成过程由9个高度保守的酶促反应组成。前7种酶可催化产生kdo2-lipid iva，它是二级酰基转移酶lpxl和lpxm的受体。在大肠杆菌中，次级酰基转移酶lpxl、lpxm或lpxp促进了类脂a与次级酰基链的酰化。在环境温度下，lpxl将c12:0转移到kdo2-lipid iva的c2’位置，随后lpxm在c3’位置加入c14:0，从而形成kdo2-lipida。当温度降低时，可能会发生lpxp基因的激活。此时lpxp会转移c16:1酰基链到c2’位。

3、副溶血弧菌作为一种常见的食源性致病菌，同样也是一种革兰氏阴性菌，广泛分布在世界各地温暖的河口和海洋中。它是全球公认的因摄入未经充分烹饪的海鲜而导致肠胃炎的病因。副溶血弧菌的致病能力和对抗生素的耐药性与lps密切相关。在副溶血弧菌中观察到多种未确定的类脂a种类，需要进一步研究以确定其精确结构并阐明相关基因的功能。目前，已发现与副溶血弧菌类脂a的次级酰基转移酶相关的基因，即vp_rs12170、vp_rs08405、vp_rs01045和vp_rs00880。vp_rs01045可在类脂a的c3’位添加月桂酸酯，与大肠杆菌中次级酰基转移酶lpxm的功能类似。vp_rs00880、vp_rs12170和vp_rs08405与大肠杆菌lpxl的同源性超过40％。然而，与vp_rs00880相比，vp_rs12170在c2’位添加c14:0脂肪酸链的能力较弱。vp_rs12170次级酰基转移酶的具体功能还未得到确定，因此需要利用遗传背景清晰且生长状况良好的大肠杆菌作为辅助菌株对副溶血弧菌类脂a酰基转移酶编码基因vp_rs12170进行进一步的鉴定。

技术实现思路

1、技术问题与技术方案：

2、本发明的第一个目的是提供一类新型类脂a，所述类脂a在c2’位含有3-羟基肉豆蔻酸次级脂肪酸链，其结构如下式(1)或式(2)所示：

3、式(1)：

4、

5、式(2)：

6、

7、本发明第二个目的是提供能直接生产所述新型类脂a的大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌敲除大肠杆菌基因组上lpxl基因、lpxm基因、lpxm基因和waaa基因，并过表达副溶血弧菌vp_rs12170。在大肠杆菌中，所有的次级脂肪酸链都是饱和的脂肪酸链，没有自然存在能合成类脂a的次级脂肪酸链含有羟基的大肠杆菌。本发明中所述重组大肠杆菌基因工程菌是分别将大肠杆菌w3110染色体中lpxl、lpxm、lpxp以及waaa基因进行敲除，并过表达了来自副溶血弧菌基因组中的次级酰基转移酶基因vp_rs12170。

8、所述lpxl基因编码的蛋白可以在类脂a的c2’位添加c12:0脂肪酸链。所述lpxm基因编码的蛋白可以在类脂a的c3’位添加c14:0脂肪酸链。所述lpxp基因编码的蛋白可以在低温下向类脂a的c2’位添加c16:1脂肪酸链。所述waaa基因编码的蛋白可以依次向lipidiva添加两个kdo基团。

9、在一种实施方式中，所述大肠杆菌lpxl基因的ncbi序列登录号为nc_007779.1(1,117,239..1,118,159)，氨基酸序列的ncbi上登录号为genbank:baa35852.1。

10、在一种实施方式中，所述大肠杆菌lpxm基因的ncbi序列登录号为nc_007779.1(1,940,936..1,941,907)，氨基酸序列的ncbi上登录号为genbank:baa15663.1。

11、在一种实施方式中，所述大肠杆菌lpxp基因的ncbi序列登录号为nc_007779.1(2,501,091..2,502,011)，氨基酸序列的ncbi上登录号为genbank:baa16248.1。

12、在一种实施方式中，所述大肠杆菌waaa基因的ncbi序列登录号为nc_007779.1(3830598-3831875)，氨基酸序列的ncbi上登录号为genbank:bae77659.1。

13、在一种实施方式中，所述副溶血弧菌vp_rs12170基因的ncbi序列登录号为nc_004603.1(2,646,669..2,647,598)，氨基酸序列的ncbi上登录号为genbank:bac60772.1。

14、本发明第三个目的是提供制备所述新型类脂a的方法，所述方法为将所述大肠杆菌基因工程菌接种于培养基中，培养一定时间后，离心收集菌体，提取类脂a。

15、在一种实施方式中，所述培养的温度为35～38℃。

16、在一种实施方式中，使用blighdyer混合体系提取类脂a。

17、在一种实施方式中，采用i相bligh-dyer混合体系氯仿、甲醇和水(1:2:0.8，v/v/v)重悬菌体，室温下磁力搅拌后离心，上清液加入氯仿和水，得到ii相混合体系氯仿、甲醇和水(2:2:1.8，v/v/v)；下相沉淀加入醋酸钠沸水浴后加入甲醇与氯仿继续配成ii相体系；两个ii相体系分别混合均匀后再次离心收集下相，吹干得到类脂a。

18、本发明第四个目的是提供一种组合物，所述组合物含有所述新型类脂a。

19、在一种实施方式中，所述组合物中包括由病毒、细菌、真菌、过敏原、寄生虫或癌细胞制备或由其产生的抗原。

20、本发明的第五个目的是提供一种免疫佐剂，所述免疫佐剂包含所述新型类脂a。

21、本发明还提供了所述新型类脂a在制备免疫动物的药物中的应用。

22、有益效果：

23、本发明采用了非致病菌大肠杆菌w3110，通过敲除基因组上lpxl基因、lpxm基因、lpxm基因和waaa基因，并过表达副溶血弧菌vp_rs12170，制备了可以直接生产以3-羟基肉豆蔻酸为次级脂肪酸链的类脂a的大肠杆菌，经过鉴定以3-羟基肉豆蔻酸为次级脂肪酸链的类脂a为一种新型类脂a，本发明拓宽了类脂a应用范围。在不同大肠杆菌宿主中分别表达了vp_rs12170片段对类脂a进行分子结构的改造，采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法，可以快速有效地提取类脂a，相对减少生产流程和对类脂a结构的破坏。同时，本发明还有助于准确鉴定副溶血弧菌次级酰基转移酶基因，有利于副溶血弧菌致病机理与免疫反应的进一步探究。