一种分级介孔金属有机骨架的制备方法及其应用

本发明涉及生物，尤其涉及一种分级介孔金属有机骨架的制备方法及其应用。

背景技术：

1、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)及其变异株的快速传播严重影响了全球公共卫生。目前迫切需要开发有效且通用的疫苗佐剂，以应对正在出现的sars-cov-2变异体和未来突发的未知新传染病。

2、sars-cov-2核心蛋白的受体结合域(receptor-binding domain,rbd)是一种有前景的covid-19候选疫苗。由于rbd具有良好的安全性，易于快速和大规模生产，因此rbd抗原疫苗可以加速开发和部署，确保及时向公众提供。不幸的是，基于rbd的亚单位疫苗面临着未得到满足的重大挑战，主要是由于其相对较低的免疫原性。因此，抗原和免疫激动剂的共递送合理设计为增强亚单位疫苗的免疫效果提供了有效策略。

3、既往研究表明，t细胞介导的细胞免疫在抗击冠状病毒感染中发挥着至关重要的作用。明矾是目前广泛用于公共卫生疫苗接种的佐剂，可有效增强对游离抗原的免疫应答，并促进抗原特异性抗体的分泌。遗憾的是，铝基疫苗缺乏细胞免疫是其主要的限制。

4、在众多纳米材料中，纳米级金属有机骨架因其具有较大的比表面积、可修饰的功能化孔隙以及潜在的系统性结构变化，已成为递送药物和增强免疫的潜在候选材料。

5、然而，大部分金属有机框架(metal-organic framework,mof)的微孔结构对于递送大于2纳米的物质(特别是功能性生物大分子，如蛋白质)的可及性非常低。在纳米金属有机骨架中，创建合适的大孔径同时避免框架崩溃具有挑战性。近年来，各种制备介孔金属有机骨架的方法被提出。例如，长配体被用于金属有机骨架的孔隙膨胀，但在溶剂去除和结构互穿过程中，不稳定性几乎是不可避免的。此外，为了制造大的孔隙，诱导缺陷形成策略已被广泛采用，但遗憾的是，孔隙率低、孔隙大小不均匀和孔隙的随机排列仍然限制了生物分子的装载和运输。

6、因此，本领域的技术人员致力于开发一种迫切需要一种有效的方法来开发具有合适粒径和适当稳定性的分级介孔金属有机骨架，以扩大其在生物医学领域的应用。

技术实现思路

1、有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何开发具有合适粒径和适当稳定性的分级介孔金属有机骨架，并应用于疫苗佐剂。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种分级介孔金属有机骨架材料的制备方法，包括以下步骤：

3、步骤1、将两亲性表面活性剂椰油丙基酰胺甜菜碱和不同质量比的嵌段共聚物(pluronics)f127溶解在去离子水中得到溶液；

4、步骤2、加乙酸加入步骤1得到的溶液中；随后，加入氧氯化锆和反丁烯二酸，得到混合液；

5、步骤3、将步骤2得到的混合液在60℃下反应，离心分离得到固体产物；

6、步骤4、将步骤3得到的固体产物浸泡于甲醇盐酸溶液中，期间不断更换萃取液，将产物孔道中的椰油丙基酰胺甜菜碱全部去除，洗涤干燥。

7、进一步地，步骤1中椰油丙基酰胺甜菜碱的摩尔量为0.8mmol；去离子水为6ml。

8、进一步地，步骤1中f127与椰油丙基酰胺甜菜碱的质量比为0％、5％、10％或15％。

9、进一步地，步骤2中乙酸的摩尔量为68mmol，氧氯化锆的摩尔量为1mmol，反丁烯二酸的摩尔量为1mmol。

10、进一步地，步骤3中反应的时间为12小时；步骤4中浸泡的时间为48小时。

11、本发明还提供了一种上述方法制备的分级介孔金属有机骨架材料，材料的介孔孔径为3.0nm，粒径为500nm～150nm。

12、本发明还提供了一种分级介孔金属有机骨架材料作为疫苗佐剂的应用。

13、进一步地，包括以下步骤：

14、步骤1)将sting激动剂msa-2固定到分级介孔金属有机骨架材料的孔道中，得到固定有激动剂msa-2的分级介孔金属有机骨架材料；

15、步骤2)将新冠rbd抗原吸附到步骤1)得到的固定有激动剂msa-2的分级介孔金属有机骨架材料上，得到分级介孔金属有机骨架疫苗佐剂。

16、进一步地，步骤1)还包括将sting激动剂msa-2溶解于二甲基亚砜中，添加分级介孔金属有机骨架材料，并在25℃下搅拌12h，通过离心收集固定有激动剂msa-2的分级介孔金属有机骨架材料。

17、进一步地，步骤2)还包括将新冠rbd抗原溶解于缓冲液中，添加固定有激动剂msa-2的分级介孔金属有机骨架材料，在25℃下搅拌30min，通过离心收集分级介孔金属有机骨架疫苗佐剂。

18、在本发明的较佳实施方式1中，详细说明了分级介孔金属有机骨架纳米佐剂的制备方法的工艺流程；

19、在本发明的较佳实施方式2中，详细说明了制备分级介孔金属有机骨架纳米材料的过程；

20、在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明了应用分级介孔金属有机骨架纳米材料应用于疫苗佐剂的制备过程。

21、本发明有益的技术效果如下：

22、根据本发明的粒径可调的分级介孔金属有机骨架纳米材料的制备方法，通过两亲性表面活性剂椰油丙基酰胺甜菜碱(capb)和嵌段共聚物f127得到一系列粒径可调的分级介孔金属有机骨架纳米材料(hm801)。在改变f127量下，可将粒径减小。去除capb后，通过后吸附sting激动剂msa-2和rbd抗原到分级介孔金属有机骨架纳米材料的孔道中，实现了msa-2和rbd的高效负载和免疫递呈细胞的递送，此方法具有普遍适用性，为小分子药物和功能蛋白的共负载和细胞递送提供了新的方法和思路。

23、本发明使用椰油丙基酰胺甜菜碱(capb)和pluronics f127在水相中合成了分级介孔mof-801((hierarchical mesoporous,hm801)。capb通过与mof的zr金属的配位作用使金属团簇在capb周围紧密生长，f127通过氢键作用进一步分散稳定，形成纳米级hm801。合成的hm801具有介孔和微孔结构。hm801具有超大的比表面积，3.0nm的孔径和优异的稳定性。

24、使用hm801将msa-2和rbd抗原高效装载在介孔中(r@m@hm801)，可以有效的递送激动剂和抗原，提高药物利用率。msa-2通过与zr金属的配位作用高效负载和rbd通过静电作用吸附到介孔中。hm801能够同时负载28.3wt％的msa-2和15.59wt％的rbd。而微孔mof-801只能负载0.42wt％的msa-2。

25、r@m@hm801能够被dc细胞高效摄取，并从溶酶体逃逸，释放msa-2和rbd抗原引起高效的免疫反应。r@m@hm801通过小窝蛋白，网格蛋白，大胞饮多种途径被dc细胞摄取，并逃逸溶酶体。在细胞质中通过磷酸盐释放msa-2和rbd。r@m@hm801在2小时内就能快速的进入dc细胞。并在24小时内，逃逸溶酶体，释放msa-2和rbd，激活dc细胞的共刺激分子cd80，cd86和mhc-i。

26、以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。