CymR核酸构建物、CymR载体、CymR/CuO载体系统、病毒包装载体系统、工程化细胞及病毒的包装方法与流程

本技术涉及分子生物学，特别涉及cymr核酸构建物、cymr载体、cymr/cuo载体系统、病毒包装载体系统、工程化细胞及病毒的包装方法。

背景技术：

1、转染基因的严格控制诱导表达极大地促进了相关的生物系统中的基因功能研究。随着对哺乳动物细胞内源性的诱导系统的研究深入，一种源自恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)的操纵子系统被用来构建真核细胞可诱导系统，并被运用于生物学基础研究领域。该真核细胞可诱导系统是一种基于4-异丙基苯甲酸(cumate，枯酸)的诱导系统，也可称为cumate调控系统。借助于该真核细胞可诱导系统，同时调节表达水平和持续表达时间成为可能。

2、cumate调控系统(也称为cuo-cymr可诱导系统)的调节可以通过阻遏蛋白cymr与操纵子cuo的结合来介导。cumate调控系统的作用原理是：阻遏蛋白cymr能特异性结合到启动子下游序列，这个特异性结合的序列称之为cuo(cumate operator，cumate操纵子)元件。诱导剂不存在的情况下，阻遏蛋白cymr与操纵子cuo特异性结合时，启动子下游的转录被抑制；而在诱导剂存在的情况下，cumate诱导剂能够与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白cymr无法与cuo元件结合，从而消除了对启动子的转录的抑制。基于此，能够选择性地开启或关闭启动子的转录，可诱导的启动子的典型代表如可诱导的哺乳动物细胞的启动子。

3、然而上述的调控方法仍存在一定局限性，例如，处于调控系统“关闭”状态下的一些基因“泄露”，抑制启动子的转录失效，以及诱导剂的多重影响，例如热激、重金属积累、糖皮质激素反应等。

4、因此，有必要开发一种可以降低cumate调控系统在“关闭”状态下的“泄露”问题的新技术。

技术实现思路

1、基于此，本技术至少提供一种cymr核酸构建物、cymr载体、cymr/cuo载体系统、病毒包装载体系统、工程化细胞及病毒的包装方法。该cymr核酸构建物包括经密码子优化的cymr核苷酸序列或其互补序列，基于该cymr核酸构建物构建得到的cymr/cuo载体系统、病毒包装载体系统可以在没有诱导剂时(也称“关闭”状态)使启动子下游的转录被抑制地更加彻底。

2、上述目的可通过如下技术方案实现。

3、在本技术的第一方面，提供一种cymr核酸构建物，所述cymr核酸构建物包括第一核酸片段和第二核酸片段中至少一种：

4、所述第一核酸片段为氨基酸序列如seq id no.:1所示的cymr蛋白的编码序列，所述第一核酸片段的核苷酸序列如seq id no.:3所示；

5、所述第二核酸片段的核苷酸序列为与所述第一核酸片段互补的核苷酸序列。

6、在一些实施方式中，所述的cymr核酸构建物包括cymr融合蛋白的编码序列以及与所述cymr融合蛋白的编码序列互补的核苷酸序列中的至少一种；

7、其中，所述cymr融合蛋白包括所述cymr蛋白构成的功能片段。

8、在一些实施方式中，所述cymr融合蛋白为所述cymr蛋白与标签肽形成的融合蛋白，所述标签肽可操作性地连接于所述cymr蛋白的n端和c端中至少一种位置；所述标签肽选自荧光标签和纯化标签中的一种或多种。

9、在一些实施方式中，所述cymr核酸构建物的核苷酸序列如seq id no.:3所示；

10、或者，所述cymr核酸构建物的核苷酸序列如seq id no.:9所示。

11、在本技术的第二方面，提供一种cymr载体，其包括本技术第一方面所述的cymr核酸构建物构成的核酸片段。

12、在一些实施方式中，所述的cymr载体满足如下特征中的一项或多项：

13、所述cymr载体为整合型载体或非整合型载体；

14、所述cymr载体为病毒载体或非病毒载体；

15、所述cymr载体为表达型载体。

16、在本技术的第三方面，提供一种cymr/cuo载体系统，其包括第一载体和第二载体；

17、所述第一载体为本技术第二方面所述的cymr载体，所述cymr载体包括第一基因表达盒，所述第一基因表达盒包括所述第一核酸片段；

18、所述第二载体包括第二基因表达盒，所述第二基因表达盒包括目的基因以及可操作地连接于所述目的基因上游的cuo操纵子元件。

19、在一些实施方式中，所述cuo操纵子元件的核苷酸序列如seq id no.:7所示。

20、在一些实施方式中，所述第一载体和所述第二载体各自独立地为病毒载体或非病毒载体。

21、在一些实施方式中，所述第一载体和所述第二载体中的至少一种为病毒载体，任一种所述病毒载体独立地为腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体。

22、在本技术的第四方面，提供一种病毒包装载体系统，其包括本技术第三方面所述的cymr/cuo载体系统；

23、其中，所述第二载体为病毒包装载体。

24、在一些实施方式中，所述第二载体为慢病毒包装载体，则所述病毒包装载体系统为慢病毒包装载体系统，所述慢病毒包装载体系统为二质粒、三质粒或四质粒包装系统；或者，

25、所述第二载体为腺相关病毒包装载体，则所述病毒包装载体系统为腺相关病毒包装载体系统；或者，

26、所述第二载体为腺病毒包装载体，则所述病毒包装载体系统为腺病毒包装载体系统，所述腺病毒包装载体系统为admax系统或adeasy系统。

27、在一些实施方式中，所述第二载体为慢病毒包装载体，所述第一载体为gag-pol辅助质粒，所述病毒包装载体系统还包括包膜蛋白质粒；或者，

28、所述第二载体为腺相关病毒包装载体，所述第一载体为携带aav rep基因和aavcap基因的辅助质粒，所述病毒包装载体系统还包括辅助病毒载体，可选地，所述辅助病毒载体包括腺病毒辅助质粒；或者，

29、所述第二载体为腺病毒包装载体，所述病毒包装载体系统还包括骨架质粒；或者，

30、所述第二载体为腺病毒包装载体与相应的骨架质粒重组并线性化后的重组腺病毒载体。

31、在一些实施方式中，所述第二基因表达盒中的目的基因是当其表达时对病毒包装产生负面影响的基因。

32、在一些实施方式中，所述目的基因满足如下特征中的一项或多项：

33、所述目的基因所编码的蛋白对包装细胞产生细胞毒性；

34、所述目的基因选自自杀基因、细胞凋亡基因和癌基因中的任一种；

35、所述目的基因是直接抑制病毒的复制和组装中至少一种过程中的基因。

36、在一些实施方式中，所述第二载体为慢病毒包装载体，所述目的基因选自caspase家族蛋白基因、c1v1(t/t)-ts-mcherry融合基因、mcp-p65-hsf1融合基因、ubxn基因家族、march8基因和m2bp基因中的任一种；所述caspase家族蛋白基因包括casp8基因、casp9基因、casp10基因、casp3基因、casp6基因和casp7基因中的一种或多种；或者，

37、所述第二载体为腺相关病毒包装载体，所述目的基因选自gpr78基因、cdkn1a基因以及apobec基因中的任一种；或者

38、所述第二载体为腺病毒包装载体，所述目的基因选自cre基因、icre基因和caspase家族蛋白基因中的任一种；所述caspase家族蛋白基因包括casp8基因、casp9基因、casp10基因、casp3基因、casp6基因和casp7基因中的一种或多种。

39、在本技术的第五方面，提供一种工程化细胞。

40、在一些实施方式中，所述工程化细胞的至少一种分泌蛋白包括氨基酸序列如seqid no.:1所示的cymr蛋白构成的功能片段；

41、所述工程化细胞中的至少一种核酸分子包括本技术第一方面所述的cymr核酸构建物构成的核酸片段。

42、在一些实施方式中，所述的工程化细胞满足如下特征中的至少一项：

43、所述工程化细胞的基因组整合有本技术第一方面所述的cymr核酸构建物的核苷酸序列；

44、所述工程化细胞含有本技术第二方面所述的cymr载体，且所述cymr载体为非整合型载体；

45、将本技术第三方面所述的cymr/cuo载体系统转入宿主细胞而获得的工程化细胞；

46、将本技术第四方面所述的病毒包装载体系统转入包装细胞而获得的工程化细胞。

47、在本技术第六方面，提供一种病毒的包装方法，其包括如下步骤：

48、将本技术第四方面所述的病毒包装载体系统转入合适的包装细胞，获得的工程化细胞的至少一种分泌蛋白包括氨基酸序列如seq id no.:1所示的cymr蛋白构成的功能片段，且所述工程化细胞载有所述的病毒包装载体系统中的目的基因；

49、孵育所述合适的包装细胞以进行所述病毒的包装；在进行所述病毒的包装过程中，所述的目的基因的表达被抑制。

50、在一些实施方式中，所述的病毒的包装方法满足如下特征中的一项或多项：

51、将所述的病毒包装载体系统转入合适的包装细胞的步骤中，以转染方式转入；

52、所述目的基因是当其表达时对病毒包装产生负面影响的基因，孵育所述合适的包装细胞以进行相应病毒的包装的步骤中，枯酸不存在；

53、所述的病毒包装载体系统中的第二载体为腺相关病毒包装载体或腺病毒包装载体，所述合适的包装细胞为hek-293细胞或其能够提供腺病毒e1区的衍生株；所述的衍生株包括hek-293a、hek-293s、hek-293sg、hek-293sggd、hek-293t、hek-293t/17sf、hek-293h、hek-293e、hek-293-6e、hek-293f、hek-293ft、hek-293ftm、aav-293以及gp2-293中的至少一种。

54、本技术提供的cymr核酸构建物包括经密码子优化的cymr核苷酸序列或其互补序列，可以显著提高cymr蛋白功能片段的表达水平。基于该cymr核酸构建物可构建得到任意类型的cymr载体，可以为整合型载体或非整合型载体，可以为病毒载体或非病毒载体，还可以为表达型载体。

55、基于该cymr核酸构建物还可以构建cymr/cuo载体系统，该cymr/cuo载体系统同时包括用于合成cymr蛋白功能片段的第一载体以及携带有cuo操纵子元件的第二载体，可用于构建能够选择性开启或关闭启动子的转录的cumate调控系统。在没有诱导剂时(也称“关闭”状态)，能够使启动子下游的转录被抑制地更加彻底。

56、利用包括该cymr/cuo载体系统的病毒包装载体系统，能够在进行病毒包装和生产时更加彻底地抑制目的基因的表达。当目的基因的表达对出毒具有负面影响时，该目的基因可称为“负面目的基因”，借助于cumate调控系统可以在病毒包装和生产时通过控制诱导剂cumate不存在来选择性抑制负面目的基因的表达，而且可以更加有效地抑制目的基因的表达，可显著促进病毒包装过程中的病毒产生，有效提高病毒的生产效率和滴度，同时还能够在靶细胞中控制诱导剂cumate存在从而不影响目的基因(作为外源基因)的表达。由此，可以在病毒包装和生产环节以及目的基因编码的目的蛋白的合成环节选择性地控制目的基因的表达，此外，还可以同时调节表达水平和持续表达时间。