一种热稳定性高的空肠弯曲杆菌噬菌体及其应用的制作方法

本发明涉及噬菌体，特别涉及一种热稳定性高的空肠弯曲杆菌噬菌体及其应用。

背景技术：

1、空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)是世界范围内引起人类细菌性肠胃炎最常见的的人兽共患病原菌之一，在每年感染弯曲杆菌的约900万人中，空肠弯曲杆菌引发的病例数约占90％，结肠弯曲杆菌引发的病例数约占10％。空肠弯曲杆菌作为家禽体内常见的寄生细菌，通常对家禽不具有致病性，却会威胁人类的健康。有实验表明，最低口服500-800cfu空肠弯曲杆菌就会导致人感染弯曲杆菌病。家禽，尤其是鸡在整个生产过程中持续地向外部环境进行排菌，严重影响了人的安全与健康。

2、家禽作为空肠弯曲杆菌最常见的宿主，被认为是空肠弯曲杆菌病最主要的来源。空肠弯曲杆菌可以在家禽肠道内大量定殖，并通家禽生产过程进行传递，最终传播给人，对人类的生命健康造成威胁。

3、大量研究发现，鸡群通常在2-3周后开始出现弯曲杆菌的感染，且一旦有一只鸡感染，弯曲杆菌便会通过粪口、食物和水源等途径在数天之内迅速感染整个鸡群。基于弯曲杆菌的传播特点，养殖环节中，弯曲杆菌的防控手段主要包括以下三类：①通过生物安全措施阻断弯曲杆菌的传播；②使用抗菌物质降低鸡体内的弯曲杆菌定殖水平；③通过免疫等方式增强鸡群对弯曲杆菌的抵抗能力。

4、在家禽屠宰过程中，空肠弯曲杆菌的污染问题无法得到彻底的控制，会造成下游生产环节的空肠弯曲杆菌污染。鸡群初始污染水平对屠宰过程中的弯曲杆菌污染水平有着显著的影响。低感染鸡群的屠宰流程中鸡群阳性率都维持在极低水平，到分割环节阳性率仅为2.00％，而高感染组鸡群在进入屠宰生产线后，鸡胴体样品阳性率迅速升高，到分割环节阳性率高达80.00％，这证明了在养殖环节控制弯曲杆菌的污染水平，能够有效地降低屠宰环节中的弯曲杆菌污染水平。

5、在养殖过程中，可通过喂服兽药，在饲料中添加抑菌杀菌成分的饲料添加剂，喂服有抑菌效果的益生菌或多糖类添加剂等方式控制空肠弯曲杆菌的污染水平。其中，因鸡的消化道相对较短，肠道黏膜屏障脆弱，在集约化养殖条件下，与长消化道动物相比更加容易受到不良微生物的侵害，导致各类疾病的发生。使用饲料添加剂是防治肠道疾病、改善肉鸡和蛋鸡生产性能的有效手段之一。

6、饲料添加剂常以饲料颗粒形式存在，饲料颗粒化的优点是减少了运输与投料过程的饲料损失。增加了可口性。限制动物对饲料的选择，减少饲料的浪费，在制作颗粒化饲料添加剂过程中通常会经过60-100℃的高温，对用以生产的噬菌体热稳定性有很高的热稳定性要求。

7、因此，亟待开发一种热稳定性高的、耐酸碱的、稳定遗传且裂解率高的噬菌体产品用于防治空肠弯曲杆菌。

技术实现思路

1、本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种热稳定性高的空肠弯曲杆菌噬菌体及其应用。本技术在家禽养殖场进行了空肠弯曲杆菌噬菌体的分离，并利用不同分型的空肠弯曲杆菌完成噬菌体的初步筛选。在此基础上，筛选高热稳定性的噬菌体，并对其进行热稳定性的测定和其他生物学性能的测定，从中分离得到一株高热稳定性的空肠弯曲杆菌噬菌体。

2、本发明具体技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种热稳定性高的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003，所述噬菌体rdp-cj-22003的保藏编号为：cgmcc no.45407

4、第二方面，本发明提供了一种杀菌组合物，包括如第一方面所述的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003。

5、进一步的，所述杀菌组合物中还包括用于抗空肠弯曲杆菌的抗生素。

6、进一步的，所述抗生素包括β-内酰胺类、氨基糖类、四环素类、大环内酯类、林可胺类、多肽类、多磷类中的任意一种。优选的，所述抗生素包括阿莫西林、安普霉素、阿米卡星、新霉素、单硫酸卡那霉素、多西环素、氟苯尼考、金霉素、土霉素、泰乐菌素、替米考星、林可霉素、黏菌素、磷霉素钠中的任意一种。

7、第三方面，本发明还提供了第一方面所述的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003或者第二方面所述的杀菌组合物在制备预防和/或治疗空肠弯曲杆菌感染的疾病的药物中的应用。同时，本发明还提供了第一方面所述的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003或者第二方面所述的杀菌组合物在制备预防和/或治疗空肠弯曲杆菌感染的疾病的饲料中的应用。

8、第四方面，本发明提供了一种生物制剂，所述生物制剂的有效成分包括如第一方面所述的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003或者第二方面所述的杀菌组合物。

9、第五方面，本发明提供了一种饲料添加剂，所述饲料添加剂的有效成分包括如第一方面所述的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003或者第二方面所述的杀菌组合物。

10、第六方面，本发明提供了一种家禽饲料，所述饲料包含第五方面所述的饲料添加剂。

11、第七方面，本发明还提供了一种消毒剂，所述消毒剂的有效成分包括如第一方面所述的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003。

12、本发明具有如下优点：

13、1、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003在家禽肠道中广泛存在，易分离，产品开发周期短；对其宿主具有专一性，不会损害正常的肠道菌群；此外，还具有自我复制和自限性特征等优点，为工业化生产噬菌体用于预防或者治疗空肠弯曲杆菌病的防治、环境消毒提供了噬菌体来源。

14、2、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003在ph6-8的条件下，37℃培养1h后，其效价仅下降1个数量级，效价仍保持在108pfu/ml以上，说明rdp-cj-22003有较好的耐酸碱性能。

15、3、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003在60℃处理60min，效价仅下降一个数量级，仍保持在107pfu/ml，经70℃处理60min，80℃处理10min，效价仍保持在105pfu/ml，对温度有较高的耐受性，rdp-cj-22003对温度具有较高的耐受性，在噬菌体的生产、运输和存储中有非常重要的意义。

16、4、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003连续传30代后，测定其效价，其效价稳定在108pfu/ml以上，说明该噬菌体具有较好的遗传稳定性，适合工业化生产。

17、5、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003裂解率达97.88％，对宿主有良好的裂解效果，适合在养殖过程中使用。

18、6、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003与抗生素协同作用，是一种安全、高效、廉价的防控抗生素耐药空肠弯曲杆菌的方法，实验证明，通过与多种抗生素的协同实验，证实该噬菌体可以与β-内酰胺类、氨基糖类、四环素类、大环内酯类、林可胺类、多肽类和多磷类抗生素有较好的协同作用，可以有效降低抗生素的使用量，将其mic降至至原来的1/2-1/16，提高养殖收益，保障食品安全、保护消费者健康。

19、7、本发明提供的空肠弯曲杆菌噬菌体rdp-cj-22003与课题组前期成果噬菌体rdp-cj-22002相比，在热稳定性方面具有显著进步。