一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶及D-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶

本发明涉及生物，尤其是涉及一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶及d-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶。

背景技术：

1、甜味是人类与生俱来的味觉追求。然而，长期以来由糖类过度摄入引起的超重、糖尿病、“三高”之类的慢性疾病以及由此产生的一系列次生健康问题也日益凸显。美味和健康始终是民众向往美好生活的双重需求，因此，低热量甜味替代品的开发和应用成为同时保证美味和健康的有效途径。

2、d-阿洛酮糖(d-allulose)是一款与蔗糖理化性质、质构特征、加工性能最为接近的低热量甜味剂，它的甜度为蔗糖的70％，但热量只有0.4kcal/g，其具有减少膳食d-果糖和d-葡萄糖的吸收、增强胰岛素抵抗、抗肥胖活性、降血脂等理化性质。d-阿洛酮糖因其较高的甜度和较低的能量以及独特的生理功能和潜在的健康益处，已成为全球范围内稀有糖生物合成领域的研究热点。

3、d-阿洛酮糖(d-allulose)属于己酮糖，是d-果糖的c-3差向异构体，目前d-阿洛酮糖的合成主要分为化学合成法和生物催化法，但化学合成法因其具有分离困难、副产物多、化学废物的产生等较难克服的共性缺点，在工业中已很少使用，绿色环保的生物酶法利用d-阿洛酮糖-3-差向异构酶(dpease)可以催化d-果糖生成d-阿洛酮糖，且无副产物生成，是高效生产d-阿洛酮糖的方式。

4、然而，传统的生物酶法合成d-阿洛酮糖的过程中，由于游离的粗酶存在化学稳定性差、酶反应结束后收集困难等缺点，不利于自动化生产且生产成本过大。故而通过固定化酶技术将d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化，与游离酶相比，固定化酶不仅能保持酶催化高效和专一的特点，而且能大大提高酶的热稳定性和化学稳定性。目前已有技术报道的dpease固定化酶技术主要是以海藻酸钠为载体的包埋法和以单一树脂为载体的吸附法固定，例如张明站等通过海藻酸钠包埋和cacl2交联固定化dpease酶，重复使用10次后酶活回收率保持在初始酶活的65％以上(公开号cn116355888a)；佟毅等以大孔树脂为载体固定化dpease，反应10批次酶活性无明显衰退(公开号cn110438113a)；朱玥明等通过将阿洛酮糖3差向异构酶的c端融合添加了一段富含赖氨酸的标签，提高酶与载体环氧基之间的共价结合，从而加强固定化效果，提升固定化效率及重复使用率(公开号cn112831489a)。虽然这些方法解决了游离酶化学稳定性差和反应结束后收集困难等问题，但这些方法通常存在酶的活性发生大幅度下降和降低酶的固定化量等问题，且需要先对酶进行分离纯化，增加了固定化成本。因此，开发一种能够把酶和固定化载体特异性结合，实现酶的定向固定化，从而有利于底物进入到酶的活性位点，在避免酶活性降低和增加酶稳定性的同时使酶得到反复多次利用，这对d-阿洛酮糖的产业发展具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶及d-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶。

2、本发明通过对d-阿洛酮糖-3-差向异构酶(dsdpease)的基因进行定点突变，使酶分子表面突变出多个半胱氨酸残基，利用巯基与树脂表面的邻苯二酚基团的特异性结合，制备定向固定化酶的方法以及提供一种高效连续化生产d-阿洛酮糖的方式，

3、本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

4、本发明的第一个目的是提供一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶，所述一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶选自氨基酸序列如下的蛋白质：

5、(1)将如seq id no.1所示氨基酸序列的第44位的丝氨酸替换为半胱氨酸；

6、(2)将如seq id no.1所示氨基酸序列的第193位的丝氨酸替换为半胱氨酸；

7、(3)将如seq id no.1所示氨基酸序列的第44位的丝氨酸替换为半胱氨酸，第264位的丝氨酸替换为半胱氨酸。

8、在本发明的一个实施方式中，所述一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶选自氨基酸序列如下的蛋白质：

9、将如seq id no.1所示氨基酸序列的第44位的丝氨酸替换为半胱氨酸，第264位的丝氨酸替换为半胱氨酸。

10、本发明的第二个目的是提供一种分离的核酸，所述的核酸是编码上述d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的核酸分子。

11、本发明的第三个目的是提供一种重组表达载体，其包含上述核酸序列。

12、本发明的第四个目的是提供一种重组表达载体转化体，其包含上述重组表达载体。

13、本发明的第五个目的是提供一种上述d-阿洛酮糖-3-差向异构酶在制备d-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶中的应用。

14、在本发明的一个实施方式中，利用d-阿洛酮糖-3-差向异构酶在制备d-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶具体包括以下步骤：

15、将氨基树脂与3,4-二羟基苯甲醛反应后，得到邻苯二酚修饰的树脂；然后将邻苯二酚修饰的树脂与d-阿洛酮糖-3-差向异构酶混匀，交联反应后得到d-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶。

16、在本发明的一个实施方式中，所述氨基树脂选自lx1000ha、lx1000epn、lx1000hfa、hfa001中的一种。

17、在本发明的一个实施方式中，所述氨基树脂与3,4-二羟基苯甲醛的质量比为8～12：1；氨基树脂与3,4-二羟基苯甲醛反应过程中，温度为室温，时间为5～8h。

18、在本发明的一个实施方式中，邻苯二酚修饰的树脂与d-阿洛酮糖-3-差向异构酶粗酶液中的用量比为1g：15～30mg。

19、在本发明的一个实施方式中，交联反应过程中，温度为0～4℃，时间为5～7h。

20、本发明的第六个目的是提供一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶，通过上述d-阿洛酮糖-3-差向异构酶制备得到。

21、本发明的第七个目的是提供一种上述d-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶在制备d-阿洛酮糖中的应用。

22、在本发明的一个实施方式中，利用d-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶在制备d-阿洛酮糖具体包括以下步骤：

23、在连续反应装置中，以果糖溶液为底物，将其与d-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶混匀，经催化反应得到d-阿洛酮糖。

24、在本发明的一个实施方式中，将果糖溶液以1～1.5ml/min的流速与d-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶混匀；

25、催化反应过程中，温度为65～75℃。

26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、本发明通过对d-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行定点突变，将酶分子表面突变成多个半胱氨酸残基，利用半胱氨酸残基中的巯基与树脂表面的邻苯二酚基团的特异性结合，实现对d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的定向固定化，有利于底物与产物进出d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的酶活中心，最大限度保留d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的催化活性。该方法操作简便，无需对d-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行纯化，可在粗酶液中特异性固定化目标酶，且酶活回收率高。该d-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶与游离酶相比，其稳定性显著提升，具有良好的连续转化能力，能够在填充柱装置中转化高浓度果糖溶液以生产阿洛酮糖；本发明中利用b.subtilis168/pmate05-dp-c44-c264突变菌株制备得到的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶定向固定化酶连续反应30h仍保持30％的转化率，且定向固定化酶的残余酶活保留95％。